Evaluationofthegeneticdiversityofavianparamyxovirustype4禽副粘病毒4型基因多樣性的評估Introduction副粘病毒科病毒已經(jīng)在世界各地的禽類、水生和陸生動物中分離出來，而大部分副粘病毒是從禽類中分離出來的副粘病毒亞科禽腮腺炎屬病毒，因此稱之為禽副粘病毒（APMVs）。APMVs分為9個血清型，APMV-1到APMV-9，最近APMV-10和APMV-11這兩種血清型分別被發(fā)現(xiàn)。IntroductionAPMV-1包含所有NDV的株型，它可以感染240種鳥類，宿主范圍非常廣泛。APMV-2，-3和-7可以感染雞和火雞等籠養(yǎng)鳥和馴養(yǎng)家禽。APMV-4，-6，-8和-9只能感染鴨和鵝等水禽APMV-5大多從鸚鵡分離出來，也可以從野鳥中分離出IntroductionAPMV-4可以造成雞的肺炎和卡他性氣管炎APMV-5能使未發(fā)育完全的鸚鵡抑郁、呼吸困難、腹瀉、斜頸和嚴(yán)重致命的腸炎，造成高死亡率APMV-6使火雞出現(xiàn)呼吸疾病并降低產(chǎn)蛋率，但對于雞無致病性APMV-7使火雞出現(xiàn)呼吸疾病和氣囊炎，并降低其產(chǎn)蛋率APMV-8和-9不造成任何疾病IntroductionAPMV是一種單股、負(fù)鏈、不分段的RNA病毒，序列長度范圍從14904nt到17262nt，可轉(zhuǎn)錄6個mRNA，進(jìn)而編碼6種蛋白，分別為核衣殼蛋白(nueleocapsidprotein，N)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(martixprotein，M)、融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn))、血凝素一神經(jīng)氨酸酶蛋白(haemagglutinin—neuraminidase，HN)和大聚合酶蛋白(largeprotein，L）APMV-6還有一個額外的第七個mMRNA，編碼一個小的疏水蛋白（SH）P基因還含有2個編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，分別是W蛋白和V蛋白IntroductionAPMV基因順序為3’-N-P-M-F-(SH)-HN-L病毒轉(zhuǎn)錄開始于3’端單獨(dú)的啟動子，其復(fù)制是由起始子（GS）和終止子（GE）介導(dǎo)的開始-終止-再開始的循環(huán)過程APMVs基因核苷酸長度是6的偶數(shù)倍，是為了有效地RNA復(fù)制和多核苷酸在核衣殼的包裝IntroductionAPMV-1的全基因序列及其抗原和序列的多樣性已經(jīng)被收錄根據(jù)F基因的序列，NDV被分為兩大類（Ⅰ和Ⅱ）。Ⅱ類進(jìn)一步分為15個基因型，包括已經(jīng)確定的基因型（Ⅰ到Ⅸ和Ⅺ），還有5種新的基因型（Ⅹ,Ⅻ,XIII,XIV和XV）而我們所知的APMV-2到-9的抗原和基因多樣性是非常有限的。APMV-2全基因序列和局部HN序列的分析顯示其有一些亞群，APMV-3全基因序列和局部M序列的分析顯示其有一些亞群存在，APMV-6序列比較顯示其存在亞群，APMV-9局部F和HN基因序列進(jìn)化分析顯示其存在亞群Introduction為了進(jìn)一步了解APMV-4的基因多樣性，對P,M,F和HN基因測序，用5組意大利鴨分離出的APMV-4進(jìn)行試驗，并與公布的香港、韓國和比利時的APMV-4序列進(jìn)行比較同時研究抗原多樣性所到達(dá)的程度Materialsandmethods病毒和細(xì)胞APMV-4分別為意大利鴨3670/06（IT-3670）意大利野鴨3936-70/06（IT-3936）意大利短頸野鴨4103-27/06（IT-4103）意大利野鴨4284-20/06（IT-4284）意大利野鴨4523-4/（IT-4523）香港鴨D3/75（HK）（國際獸醫(yī)實驗局）用9日齡SPF雞胚培養(yǎng)，免疫4天后收集感染的尿囊液，并測定各自的效價美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫提供雞胚成纖維細(xì)胞細(xì)胞系，在含10%牛胎血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用效價為28血凝單位的100倍稀釋病毒液感染該細(xì)胞（含或不含1ug/ml胰蛋白酶的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基），連續(xù)7天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)以及細(xì)胞培養(yǎng)液上清的血凝活性Materialsandmethods2.P和M擴(kuò)增引物p1331(5’-GACGACTTCCCACTGTCGGGATCCATGCCGGCTCTCTC-3’)p2005反轉(zhuǎn)錄(5’-TTGGGCCTCTTGAGTCTGGCTTTGGCTGC-3’)p1875(5’-GATCATCAGGCCAACGAC-3’)p3160反轉(zhuǎn)錄(5’-ACAGCAGTTCTTTTTGGTGGGTTGG-3’)p3043(5’-GGGCTCCCTCATCTTCAGACACG-3’)p4357反轉(zhuǎn)錄(5’-CTTTTGTTTAGACACCCAATCAACT-3’)3.Taq酶（Invitrogen）瓊脂糖凝膠電泳直接測序或復(fù)制到拓?fù)洚悩?gòu)酶載體（BDT測序試劑盒）Materialsandmethods序列對比和進(jìn)化分析theSeqManandEditSeqprogramsoftheLasergene8(DNASTAR)clustalWmultiplealignmentalgorithmsofMagAlignprogramofDNASTARthebasiclengthalignmentsearchtool(BLAST)theKimura-2parameterintheMEGAversion4.0program數(shù)據(jù)庫收錄號意大利分離的APMV-4免疫雞共7組，每組3只2周齡SPF雞，香港組，意大利5組，對照組，免疫當(dāng)天和21天收集血清血清學(xué)分析HI試驗（同源）交叉HI試驗（異源）進(jìn)行統(tǒng)計分析Results意大利株體外生長特點意大利株在9日齡雞胚和雞胚成纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞系上培養(yǎng)的復(fù)制特點與以前得到的香港株、韓國株和比利時株相似在雞胚高效復(fù)制，免疫后4天尿囊液的效價高達(dá)29HA單位，而在DF-1細(xì)胞幾乎不感染，產(chǎn)生的最大效價是24HA單位在培養(yǎng)中外源蛋白酶并不影響病毒復(fù)制ResultsP基因意大利株長度為1364nt，編碼33aa的P蛋白，這與香港株和韓國株和比利時株相同，有10個絲氨酸，6個蘇氨酸和一個絡(luò)氨酸殘基是潛在的磷酸化位點意大利株之間P基因核苷酸與轉(zhuǎn)錄的氨基酸一致性達(dá)97.2-100%和97.5-100%，與韓國株一致性達(dá)97.5-98.2%和96.6-98%，與比利時株一致性達(dá)96.6-98.8%和96.2-98.7%，與香港株一致性達(dá)89.2-90%和92.1-93.1%P基因442-450nt位置有相同編輯位點5’-AAAGGGGGG-3’，在這里有一個非模板的甘氨酸殘基，可以產(chǎn)生V蛋白（其氨基酸序列與韓國株和比利時株一致性比與香港株的高）ResultsM基因意大利株長度1293nt，編碼370aa的M蛋白（意大利株、韓國株和比利時株），香港株編碼369aa的M蛋白（3’端未翻譯區(qū)）其核苷酸和氨基酸序列一致性同樣很高F基因1891nt，566aa，其序列特點是蛋白裂解位點(DIPQR↓F)、糖基化位點、半胱氨酸和七肽重復(fù)區(qū)，然而N端有更多的變異其核苷酸和氨基酸序列一致性同樣很高ResultsHN基因1914nt，565aa（意大利和比利時），569aa（香港和韓國）（起始密碼子點突變），關(guān)鍵序列特點是糖基化殘基，神經(jīng)氨酸酶活性殘基和半胱氨酸殘基其核苷酸和氨基酸序列一致性同樣很高遺傳關(guān)聯(lián)性和進(jìn)化分析8種株型親緣關(guān)系