Chapter8ModificationofEnzymeMolecule酶分子的化學(xué)修飾Contentsofchapter81、酶分子化學(xué)修飾的基本原理2、酶分子化學(xué)修飾的方法學(xué)3、肽鏈有限水解修飾4、酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾GoGoGoGo5、大分子的結(jié)合修飾Go6、親和標(biāo)記Go8.1酶分子化學(xué)修飾的基本原理通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。酶分子修飾的意義提高酶的活力activity增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響structure

8.2酶分子化學(xué)修飾的方法學(xué)

對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。8.3肽鏈有限水解利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力。

經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp對(duì)催化活性基團(tuán)可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代。1.非極性R基氨基酸（共8種）：

丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu,L),纈氨酸(Valine,Val,V)),異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P)根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。2.無電荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S),蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)磷酸化反應(yīng)幾種重要的修飾反應(yīng)：酰化及其相關(guān)反應(yīng)試劑特點(diǎn)：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。乙酰咪唑,二異丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等可作用基團(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。氧化和還原反應(yīng)肽酰高絲氨酸內(nèi)酯C端肽段N端肽段甲基硫氰酸磷酸化反應(yīng)蛋白質(zhì)磷酸化是由蛋白激酶催化將ATP中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到氨基酸殘基的功能集團(tuán)上。常見的磷酸化修飾的基團(tuán)：絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的羥基來源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化?；揎梽?

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：氨基特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾羥基的化學(xué)修飾咪唑的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾5,5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）氨基的化學(xué)修飾N-乙基馬來酰亞胺（NEM）氨基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑

但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋孩偃魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專一的。②有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化——失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。③不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。8.5酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍共價(jià)修飾大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。8.6酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。

8.7酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。8.8酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。8.9酶分子修飾的應(yīng)用目前改造酶分子的方法主要有兩種，即化學(xué)修飾法和生物酶工程法?；瘜W(xué)修飾法

用化學(xué)方法對(duì)酶分子迸行改造，即體外在酶的側(cè)鏈基團(tuán)上接上或去掉一些化學(xué)基團(tuán)，從而改變酶的物理化學(xué)性質(zhì)，最后達(dá)到改變酶的催化性質(zhì)的目的。

酶分子的化學(xué)修飾法技術(shù)較簡(jiǎn)單。但大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，理化及生物學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，因此應(yīng)根據(jù)具體情況選定修飾方法，同時(shí)應(yīng)注意采取一些保護(hù)性措施來盡量維持酶的穩(wěn)定性及得率。生物酶工程法

酶的化學(xué)修飾法并非改造酶的惟一手段。隨著人們對(duì)酶的深入研究以及氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定、基因重組技術(shù)的應(yīng)用等，可以徹底地改造、合成并且模擬酶。這也就是生物酶工程的主要內(nèi)容。生物酶工程主要包括基因工程技術(shù)生產(chǎn)酶和蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造酶兩方面內(nèi)容。一、在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用酶的活性中心研究酶的空間結(jié)構(gòu)研究酶的作用機(jī)制（1）親和標(biāo)記法（2）差別標(biāo)記法（3）氨基酸置換法（4）核酸置換法二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用降低