第七章抗原抗體反應(yīng)與應(yīng)用第一頁，共68頁。第一節(jié)抗體的制備多抗（ployclonalantibody）單抗（monoclonalatibody）抗體庫（antibodylibrary）基因工程抗體（engineeringantibody）催化抗體（catalyticantibodyorabozyme）抗血清：含有特異性抗體的動物血清。

第二頁，共68頁。一、抗血清的制備1、免疫動物

抗原—佐劑—免疫動物2、抗血清的純化和保存

采血—抗血清的純化—保存3、抗血清的特性鑒定滴度（titer）—親和（合）力—特異性第三頁，共68頁。二、抗體的特性1抗原-抗體反應(yīng)作用力第四頁，共68頁?？乖贵w作用力

非共價鍵結(jié)合

氫鍵

離子鍵

范德華力

疏水鍵

Source:Li,Y.,Li,H.,Smith-Gill,S.J.,Mariuzza,R.A.,Biochemistry39,6296,2000

第五頁，共68頁。2抗體的特性測定滴度（Titer）是指在給定條件下，結(jié)合一定量抗原所需的最大的抗血清稀釋倍數(shù)。（因方法不同有差異）特異性（Specificity）特異性檢測/競爭性檢測親和力（Affinity）和親合力（Avidity）第六頁，共68頁。親和力是單個抗原表位與單個抗體結(jié)合位點之間的作用力，反映抗體與抗原表位特異性結(jié)合強弱的量化指標(biāo)。AbAgHighAffinityAbAgLowAffinity第七頁，共68頁。CalculationofAffinityAg+AbAg-AbKeq=

[Ag-Ab][Ag].

[Ab]ApplyingtheLawofMassAction:

Reversible第八頁，共68頁。親合力（Avidity）p156多價抗原與抗體結(jié)合強度的總體評價

，反映抗原抗體結(jié)合的總體效果。（提高濃度改善抗原抗體親和性）Keq=104Affinity106Avidity1010Avidity第九頁，共68頁。3影響抗原-抗體反應(yīng)的因素親和力親合力抗原抗體比例AbexcessAgexcessEquivalence–Latticeformation抗原的物質(zhì)形式環(huán)境條件

溫度、離子濃度等第十頁，共68頁。Polyclonalantibodiescanformlattices,orlargeaggregates,thatprecipitateoutofsolution.Ifeachantigenmoleculecontainsonlyasingleepitoperecognizedbyagivenmonoclonalantibody,theantibodycanlinkonlytwomoleculesofantigenandnoprecipitateisformed.第十一頁，共68頁。第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理

抗原抗體反應(yīng)是非共價的特異性可逆反應(yīng)。

體外免疫檢測的原理。一、抗原抗體反應(yīng)的熱力學(xué)與動力學(xué)1溶液中抗原抗體反應(yīng)的化學(xué)平衡Ag+Ab=Ag-AbKα=[SL]/[S][L]=K+/K-p152Kα:平衡常數(shù)或內(nèi)在親和力。Kd:解離常數(shù)第十二頁，共68頁。達到反應(yīng)平衡需要的時間較長，但反應(yīng)進行90%很容易。Kα相同并不能說明K+和K-的大小。

K+大時，有利于結(jié)合，抗原抗體結(jié)合穩(wěn)定K-大時，達到平衡點快，結(jié)合不穩(wěn)定。前者用于標(biāo)記，后者用于親和層析。第十三頁，共68頁?？贵w結(jié)合抗原的特異性同源抗原（強）異源抗原（弱）變態(tài)抗體（強）抗原末端或表面基團具有免疫優(yōu)勢三、抗體與大分子多價抗原的反應(yīng)1多抗原決定簇-大分子抗原特征

抗原決定簇（表位）-多價抗原-表位重疊第十四頁，共68頁。半抗原為單抗原決定簇結(jié)合在固體上具有多抗原決定簇的效果與液體中的半抗原反應(yīng)不同2抗原抗體的親和力和親合力親和力(affinity)單價抗原與抗體結(jié)合的強弱親合力(avidity)多價抗原與抗體結(jié)合強度的總體評價

3抗體與多價抗原結(jié)合的濃度帶現(xiàn)象

抗體與單價抗原結(jié)合往往形成可溶性復(fù)合物第十五頁，共68頁?？贵w與多價抗原可以形成沉淀（條件）

抗原抗體反應(yīng)時

前帶區(qū)（抗體過量，沉淀少）

等帶區(qū)（抗體抗原適量，大量沉淀）

后帶區(qū)（抗原過量，沉淀少）

初級反應(yīng)（未出現(xiàn)沉淀）

次級反應(yīng)（出現(xiàn)沉淀）第十六頁，共68頁。形成沉淀需要一定時間，另外溫度、pH值、離子強度、補體等沉淀的形成可以用網(wǎng)絡(luò)理論解釋4交叉反應(yīng)抗體與同源抗原反應(yīng)，又與異源抗原結(jié)合就產(chǎn)生了交叉反應(yīng)。同源抗原結(jié)合強，異源結(jié)合弱。第十七頁，共68頁。交叉反應(yīng)單個抗體結(jié)合位點能與不同的抗原表位發(fā)生反應(yīng)或者一個抗體能與不同的抗原反應(yīng)。當(dāng)抗原具有相同或相似的抗原表位時即可發(fā)生交叉反應(yīng)。Anti-AAbAgAAnti-AAbAgBSharedepitopeAnti-AAbAgCSimilarepitopeCrossreactionsAnti-AAbAgCSimilarepitopeCrossreactions第十八頁，共68頁。第三節(jié)常見免疫分析方法利用抗原抗體特異性反應(yīng)特點，對其中之一進行定性定量分析的方法。特異、靈敏、迅速特點。一、免疫沉淀（immuneprecipitation)

沉淀反應(yīng)：

可溶性抗原（血清蛋白、細(xì)胞裂解液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時，比例適當(dāng)，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)。第十九頁，共68頁。AprecipitationcurveforasystemofoneantigenanditsantibodiesAzoneofantibodyexcessprecipitationisinhibitedandantibodynotboundtoantigencanbedetectedinthesupernatant;anequivalencezoneofmaximalprecipitationantibodyandantigenformlargeinsolublecomplexesandneitherantibodynorantigencanbedetectedinthesupernatant;azoneofantigenexcessprecipitationisinhibitedandantigennotboundtoantibodycanbedetectedinthesupernatant.Precipitationreactions（沉淀反應(yīng)）（soluble)influidsyieldaprecipitincurve第二十頁，共68頁。

前帶區(qū)（抗體過量，沉淀少）

等帶區(qū)（抗體抗原適量，大量沉淀）

后帶區(qū)（抗原過量，沉淀少）形成沉淀需要一定時間，另外溫度、pH值、離子強度、補體等第二十一頁，共68頁。1溶液中的沉淀反應(yīng)

環(huán)狀沉淀試驗抗血清對照１:101:201:401:801:160沉淀線抗原第二十二頁，共68頁。在凝膠或瓊脂中形成可見的沉淀線2.兩種類型免疫擴散單向擴散（radialimmunodiffusion）雙向擴散（doubleimmunodiffusion）。第二十三頁，共68頁。單向擴散(radialimmunodiffusion)雙向擴散(doubleimmunodiffusion)第二十四頁，共68頁。？Singlediffusion第二十五頁，共68頁。原理:檢測抗原⑴單向免疫擴散：Ab+瓊脂制板打孔AgNSAgAg加樣觀察（含量）第二十六頁，共68頁。（2）雙向免疫擴散：瓊脂AbNS第二十七頁，共68頁。免疫電泳

血清免疫電泳鑒定-特異圖譜火箭免疫電泳對流免疫電泳第二十八頁，共68頁。（1）免疫電泳原理：電泳后雙擴

應(yīng)用：血清蛋白種類分析第二十九頁，共68頁。Anantigenpreparation(orange)isfirstelectrophoresed,whichseparatesthecomponentantigensonthebasisofcharge.

Antiserum(blue)isthenaddedtotroughsononeorbothsidesoftheseparatedantigensandallowedtodiffuse;Intime,linesofprecipitation(coloredarcs)formwherespecificantibodyandantigeninteract.ImmunoelectrophoresisCombinesElectrophoresisandDoubleImmunodiffusion第三十頁，共68頁。第三十一頁，共68頁。Rocketdiffusionantibody第三十二頁，共68頁。(3)對流免疫電泳：方法和原理：雙擴＋電泳NSAgAb第三十三頁，共68頁。Immunoprecipitationusingmagneticbeadtoprecipitateantigen4.免疫共沉淀第三十四頁，共68頁。5.免疫凝集反應(yīng)(AgglutinationReactions)抗體與顆?？乖Y(jié)合形成的可見聚集反應(yīng)。TheinteractionbetweenantibodyandaparticulateantigenresultsinvisibleclumpingcalledagglutinationHemagglutination(血細(xì)胞凝集）IsUsedinBloodTyping第三十五頁，共68頁。ABO血型系統(tǒng)特點：表型

基因型

紅細(xì)胞表面抗原

血清中天然抗體

AA/A,A/OA抗BBB/B,B/OB抗AABA/BA和BOO/OH抗A和抗B第三十六頁，共68頁。第三十七頁，共68頁。PassiveAgglutinationIsUsefulwithSolubleAntigensAgglutinationreactionsemployingsyntheticbeadscanbereadrapidly,oftenwithin3to5minutesofmixingthebeadswiththetestsample.candetectsmallamountsofantibody(concentrationsaslowasnanogramspermilliliter).Definition-agglutinationtestdonewithasolubleantigencoatedontoaparticle+第三十八頁，共68頁。Amodificationoftheagglutinationreaction,calledagglutinationinhibition,providesahighlysensitiveassayforsmallquantitiesofanantigen.凝集抑制InAgglutinationInhibition,AbsenceofAgglutinationIsDiagnosticofAntigen（eg.Bacteria)第三十九頁，共68頁。Theoriginalhomepregnancytestkitemployedhapteninhibitiontodeterminethepresenceorabsenceofhumanchorionicgonadotropin(HCG人絨毛膜促性腺激素).PregnancyMechanismofhomepregnanttestkit第四十頁，共68頁。間接凝集抑制試驗:乳膠妊娠試驗

將待測樣品中的抗原與已知抗體作用后，再與相應(yīng)抗原—乳膠顆?；旌?。因沒有游離抗體的存在，乳膠顆粒表面的抗原不能與抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，即凝集被抑制。孕婦尿液中含HCG，用抗HCG與之結(jié)合后，再加HCG—乳膠，則不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

第四十一頁，共68頁。方法1、取玻片一張，左側(cè)加生理鹽水一滴，右側(cè)加待檢尿液一滴。2、兩側(cè)各加抗HCG（HCG診斷血清）一滴，混勻2分鐘。3、兩側(cè)各加HCG—乳膠抗原一滴，混勻2分鐘，觀察結(jié)果。第四十二頁，共68頁。Agglutinationinhibitionassayscanalsobeusedtodeterminewhetheranindividualisusingcertaintypesofillegaldrugs,suchascocaineorheroin.Agglutinationinhibitionassaysarewidelyusedinclinicallaboratoriestodeterminewhetheranindividualhasbeenexposedtocertaintypesofvirusesthatcauseagglutinationofredbloodcells.第四十三頁，共68頁。二、免疫標(biāo)記

１、放射免疫分析第四十四頁，共68頁。

放射免疫測定法（RIA）：

131I、125I標(biāo)記，微量物質(zhì)測定或放射自顯影第四十五頁，共68頁。２酶聯(lián)免疫吸附試驗

EIA（Enzymeimmunoassay）

ELISA（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）直接法包被抗體-標(biāo)記抗原

包被抗原-標(biāo)記抗體第四十六頁，共68頁。ELISA原理：

將已知抗原或抗體吸附于固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用洗滌液將游離成分洗去。第四十七頁，共68頁。間接法包被抗原-一抗-標(biāo)記二抗夾心法直接夾心：包被抗體-抗原-標(biāo)記抗體

間接夾心：包被抗體-抗原-一抗-標(biāo)記二抗Dot-ElISA第四十八頁，共68頁。*間接法：

檢測抗體洗滌洗滌洗滌標(biāo)本觀察結(jié)果第四十九頁，共68頁。方法：*雙抗體夾心法：檢測抗原Ag底物包被標(biāo)本洗滌酶標(biāo)抗體第五十頁，共68頁。第五十一頁，共68頁。ELISPOT

酶聯(lián)免疫斑點測定法第五十二頁，共68頁。3熒光免疫分析膜抗原第五十三頁，共68頁。4親和標(biāo)記免疫分析

生物素-親和素（鏈親和素）親和力高地高辛-抗體第五十四頁，共68頁。Fig.3.NorthernblottingtodetectDjPrebRNA.Lane1,totalRNAofplanarians.28Sand18SrRNAbandsareindicated.Lane2,theblotwashybridizedwithDIG-labeledDjPrebRNAprobe.第五十五頁，共68頁。Fig.4.ExpressionpatternsofDjPrebmRNAinD.japonicajuvenilesdetectedbywhole-mountinsituhybridization.第五十六頁，共68頁。三、免疫定位分析

熒光免疫定位

酶標(biāo)記免疫定位免疫組化/免疫印跡第五十七頁，共68頁。蛋白印跡WesternBlotting(a)separatedbyelectrophoresisinPAGE/SDS,whichseparatesthecomponentsaccordingtotheirmolecularweight;lowermolecularweightcomponentsmigratefartherthanhighermolecularweightones.(b)Thegelisremovedfromtheapparatusandappliedtoaprotein-bindingsheetofnitrocelluloseornylonandtheproteinsinthegelaretransferredtothesheetbythepassageofanelectriccurrent.(c)Additionofenzyme-linkedantibodiesdetectstheantigenofinterest.(d)ThepositionoftheantibodiesisvisualizedbymeansofanELISAreactionthatgeneratesahighlycoloredinsolubleproductthatisdepositedatthesiteofthereaction.第五十八頁，共68頁。免疫印跡WesternBlot覆蓋轉(zhuǎn)印→硝酸纖維素膜（去垢劑）將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開4124120第五十九頁，共68頁。His-Pv重組蛋白表達SDS分析結(jié)果。M，marker；1，經(jīng)過誘導(dǎo)的帶有重組質(zhì)粒His-Pv超聲后沉淀；2，經(jīng)過誘導(dǎo)的帶有重組質(zhì)粒His-Pv超聲后上清；3，未經(jīng)誘導(dǎo)的帶重組質(zhì)粒His-Pv的菌。第六十頁，共68頁。斑馬魚卵無細(xì)胞體系中C3和Bf的Westernblot檢測（M：marker；H：人血清；Z：斑馬魚卵無細(xì)胞體系）兔抗人C3多克隆抗體和羊抗人Bf多克隆抗體與人血清和斑馬魚卵無細(xì)胞體系均有反應(yīng)。第六十一頁，共68頁。Westernblot結(jié)果表明兔抗人C3多克隆抗體和羊抗人Bf多克隆抗體與人血清和斑馬魚卵無細(xì)胞體系均有反應(yīng)（圖2-20）。兔抗人C3抗體與斑馬魚卵無細(xì)胞體系形成了三條特異性條帶，其中一條帶對應(yīng)的分子量約為185kD，與人C3的分子量大小相當(dāng)；此外，還有兩條分子量約為115kD和70kD的條帶，分別與C3α和C3β的大小相一致。斑馬魚卵無細(xì)胞體系與羊抗人Bf抗體的反應(yīng)僅產(chǎn)生了一條特異性條帶，分子量與人的Bf很接近，約為93kD。這一結(jié)果說明在斑馬魚卵子中確實存在參與替代途徑的補體成分。第六十二頁，共68頁。Fig.7LocalizationofAmphiTIP30transcriptsindifferenttissuesofadultamphioxus.(A)AmicrographshowsthepresenceofAmphiTIP30transcriptsinthefemaleamphioxusandpredominantlyexpressedintheovary.(BandC)AmicrographshowstheabsenceofAmphiTIP30incontrolsections.(D)MicrographsshowtheabsenceofAmphiTIP30inthespermaryinamphioxus.Scalebarsrepresent100lm.第六十三頁，共68頁。Fig.5.EctopicdorsalexpressionofventralmarkersandCNSduplicationafterSmed-BMPandSmed-Smad1RNAi.(A,D)Smed-eye53expressionincontrols.InpanelDwhitearrowsindicatethepharynxneuralplexusandblackarrowsindicatethevisualcells.AfterRNAi,thetreatedanimalsshowectopicdorsalSmed-eye53expression(arrowheadsinpanelsEandF).BlackarrowsinpanelsE–Findicatetheeyes.RedarrowinpanelEpointstoanextraeye.(G–R)Immunostainingoftheplanariannervoussystemwithanti-SYNORF1incontrol(G,J,M,),Smed-