實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡及其使用A第1頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六周次實(shí)驗(yàn)名稱學(xué)時(shí)數(shù)6光學(xué)顯微鏡構(gòu)造和使用37葉綠體的熒光觀察38線粒體和液泡系的超活染色與觀察39紅細(xì)胞凝集反應(yīng)和細(xì)胞膜滲透性310巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象觀察311蟾蜍骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制作3本學(xué)期細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開設(shè)項(xiàng)目和時(shí)間安排第2頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡構(gòu)造和使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解和掌握普通光鏡、暗視場顯微鏡、相差、熒光、微分干涉差、倒置等顯微鏡的原理和使用方法。同時(shí)簡單介紹電鏡原理。2．了解掌握光學(xué)顯微鏡的光路合軸方法，了解顯微攝影的基本操作。第3頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六二、原理和方法一）普通光學(xué)顯微鏡1．普通明場光學(xué)顯微鏡各零部件構(gòu)成：鏡座、柱、筒、臂、轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、調(diào)節(jié)器、光源及光源聚光鏡，視場光闌、孔徑光闌、鏡臺(tái)下聚光器、聚光器前透鏡、物鏡和目鏡。2．物鏡的種類：消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、平場物鏡。3．顯微鏡的光路原理（略）光源色光→視場光闌—折射→孔徑光闌→聚光鏡→樣品在物鏡后焦平面成像→目鏡觀察第4頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六4．顯微性能參數(shù)顯微鏡的性能參數(shù)包括分辨率、放大率，焦點(diǎn)深度、視場寬度等。1）分辨率：R=0.61λ/N.A.；N.A.＝ｎsinα/2式中：n=介質(zhì)折射率；α=孔徑角（鏡口角，物鏡最邊緣斜光線與顯微鏡光軸所成的交角），N.A.=數(shù)值孔徑（鏡口率，numericaperture）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。2）顯微鏡總放大率（Mt）=物鏡放大率×目鏡放大率×攝影透鏡放大率；有效放大率=物鏡數(shù)值孔徑的500-1000倍，故需根據(jù)物鏡選配適宜的目鏡。第5頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六5．顯微鏡的使用1）光路合軸：鏡檢與攝影前，使照明光線與顯微鏡光軸合一即為光路合軸，整個(gè)過程涉及到聚光器調(diào)中和光源燈絲調(diào)中兩部分，詳細(xì)過程參閱教材。2）光闌的調(diào)節(jié)：視場光闌用于控制照明光束可以限定視場大?。豢讖焦怅@用于限定聚光器孔徑大小。調(diào)節(jié)時(shí)以視場光闌內(nèi)緣外切孔徑光闌為基準(zhǔn)。第6頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六二）暗視野顯微鏡特殊部件：暗視野聚光器/暗視野光擋1．由于聚光器構(gòu)造的特殊性，導(dǎo)致直射光線不能進(jìn)入視野，此時(shí)視野黑暗。光線斜向照射時(shí)，樣品產(chǎn)生散射光，一部分散射光線可以進(jìn)入視野，在黑暗視野中樣品邊緣明亮。2．暗視野光檔：光擋直徑取決于物鏡數(shù)值孔徑，光擋恰好能擋住物鏡通光孔徑。另一個(gè)問題是暗視場聚光器的調(diào)中。第7頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六暗視野照明方式第8頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六三）相差顯微鏡部件構(gòu)成：環(huán)狀光闌，相差物鏡1．這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。光線經(jīng)環(huán)狀光闌投射樣品的直射光和衍射光透過物鏡相差板時(shí)，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后相互干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小，提高反差，造成不同的反差效果。2．聚光器調(diào)中，需要借助調(diào)中望遠(yuǎn)鏡調(diào)中。第9頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六四）微分干涉差顯微鏡部件構(gòu)成：起偏器+DIC棱鏡+DIC滑行器+檢偏器偏振器裝在聚光器的前面，使光線發(fā)生線性偏振，聚光器前的DIC棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，兩束光產(chǎn)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)DIC棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時(shí)兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿過第二個(gè)偏振裝置，即檢偏器，檢偏器與起偏器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗差，成像效果有浮雕立體感。為了使影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，改變影像的亮度，使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，三維立體感明顯。第10頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六DIC顯微鏡下的硅藻第11頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六五）偏光顯微鏡部件構(gòu)成：起偏器+檢偏器偏光顯微鏡用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有起偏器，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器。檢偏器偏振方向與起偏器垂直時(shí)則為正交偏光鏡，這種顯微鏡的載物臺(tái)一般是可以旋轉(zhuǎn)的，當(dāng)載物臺(tái)上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測到這種物體。第12頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六第13頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六六）熒光顯微鏡1．短波光照射樣品導(dǎo)致熒光分子被激發(fā)，分子能級(jí)躍遷，以光子的形式釋放能量。2．光源：高壓汞燈，使用時(shí)需要預(yù)熱十五分鐘，斷電后十分鐘內(nèi)不能重啟。3．濾色鏡：包括激發(fā)光濾鏡和阻斷濾鏡。4．汞燈使用前需聚焦調(diào)中。第14頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六七）倒置顯微鏡光源在上，物鏡在下，光路設(shè)計(jì)與普通顯微鏡正好相反，經(jīng)常用于觀察工作距離較大的樣品，如觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。八)電子顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是用電子束作照明源，用電磁場作透鏡，放大倍數(shù)最高可達(dá)近百