基因工程制藥介紹張義浜-05-20基因工程制藥培訓(xùn)第1頁概述目標(biāo)基因取得基因表示基因工程菌培養(yǎng)基因工程藥品分離純化基因工程制藥培訓(xùn)第2頁基因工程制藥培訓(xùn)第3頁傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在問題:1.材料起源或制造技術(shù)困難而無法研制出產(chǎn)品；

2.從動物臟器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第4頁基因工程制藥優(yōu)點(diǎn)大量生產(chǎn)過去難以取得生理活性蛋白和多肽提供足夠數(shù)量生理活性物質(zhì)發(fā)覺更多內(nèi)源性生理活性物質(zhì)利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提升藥效價(jià)值取得新型化合物，擴(kuò)大藥品篩選起源基因工程制藥培訓(xùn)第5頁基因工程技術(shù)所生產(chǎn)藥品

用傳統(tǒng)方法極難生產(chǎn)，主要是藥用活性蛋白質(zhì)/多肽，包含：（1）免疫相關(guān)蛋白各種抗原、單克隆抗體。（2）細(xì)胞因子如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素胰島素、生長激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激素。（4）酶類尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第6頁早期部分基因工程產(chǎn)品研制、開發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品研制國家用途上市國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗1983美國乙肝1986歐洲人白細(xì)胞介素（IL）1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國基因工程制藥培訓(xùn)第7頁我國同意上市部分生物技術(shù)藥品同意年份藥品同意年份藥品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰島素、Anti-CD3鼠源單抗1992IFN-α2a人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表皮生長因子（EGF）、EGF衍生物霍亂疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）抗IL-8鼠源單抗凝乳劑1995乙肝疫苗（酵母）IL-11、腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）重組人p53腺病毒注射液抗EGFR人源單抗1997粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）重組鏈激酶（γ-SK）、EPO重組人腦利鈉肽、重組人血管內(nèi)皮抑素重組人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生長激素（GH）痢疾疫苗、牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）重組TNFR-Fc融合蛋白基因工程制藥培訓(xùn)第8頁基因工程制藥培訓(xùn)第9頁

什么是基因工程技術(shù)？ 基因工程（geneticengineering）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體DNA技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不一樣生物遺傳物質(zhì)——基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后經(jīng)過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要基因在細(xì)胞中表示，產(chǎn)生出人類所需要產(chǎn)物或組建成新生物類型?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第10頁制備基因工程藥品基本過程

取得目標(biāo)基因

↓

構(gòu)建重組質(zhì)粒

↓

組建基因工程菌(或細(xì)胞)

↓

培養(yǎng)工程菌

↓

產(chǎn)物分離純化

↓

除菌過濾

↓

半成品檢定

↓

成品檢定

↓

包裝上游階段選擇表示系統(tǒng)主要考慮：必須確保所表示蛋白質(zhì)含有生物活性考慮基因工程蛋白質(zhì)表示量多少蛋白質(zhì)分離純化難易程度下游階段基因工程制藥培訓(xùn)第11頁基因克隆基因工程制藥培訓(xùn)第12頁工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而無53外切活性。慣用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)識等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替換DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)識或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)識探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基基因工程制藥培訓(xùn)第13頁目標(biāo)基因取得一、反轉(zhuǎn)錄法二、反轉(zhuǎn)錄PCR三、化學(xué)合成法慣用方法:基因工程制藥培訓(xùn)第14頁一、反轉(zhuǎn)錄法為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽DNA序列，能夠從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)真核細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，反轉(zhuǎn)錄生成該蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，最終合成編碼該多肽雙鏈DNA序列。cDNA克隆示意圖DNA聚合酶ImRNA

反轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1基因工程制藥培訓(xùn)第15頁二、反轉(zhuǎn)錄PCR

提取組織或細(xì)胞中總RNA，以其中mRNA作為模板，采取Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，直接以其為模板（不需要合成cDNA第二鏈）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取得目標(biāo)基因，用于重組、克隆。基因工程制藥培訓(xùn)第16頁三、化學(xué)合成法前提：核苷酸序列已知；或已知其蛋白質(zhì)氨基酸序列，再推導(dǎo)出核苷酸序列限制性：

1）不能直接合成太長基因；

2）遺傳密碼簡并性可造成中性突變；

3）成本較高DNA合成儀基因工程制藥培訓(xùn)第17頁基因克隆與表示基因工程制藥培訓(xùn)第18頁基因表示：基因在生物體中轉(zhuǎn)錄、翻譯及全部加工過程?；蚋咝П硎荆和庠椿蛟谀撤N宿主細(xì)胞中表示活動，即剪切下一個(gè)外源基因片段，重組到另一個(gè)基因表示體系中，使其能取得現(xiàn)有原生物活性又可高產(chǎn)表示產(chǎn)物?；虮硎狙芯恐饕獑栴}：目標(biāo)基因表示產(chǎn)量、表示產(chǎn)物穩(wěn)定性、產(chǎn)物生物學(xué)活性和表示產(chǎn)物分離純化。建立最正確基因表示體系，是基因表示設(shè)計(jì)關(guān)鍵基因工程制藥培訓(xùn)第19頁一、宿主菌選擇宿主菌應(yīng)滿足以下要求：含有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率；能利用易得廉價(jià)原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)燒量低，需氧低，適當(dāng)發(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；輕易進(jìn)行代謝調(diào)控；方便重組DNA操作；產(chǎn)物輕易提取純化?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第20頁1.原核細(xì)胞（1）大腸桿菌表示產(chǎn)物形式：細(xì)胞內(nèi)不溶性表示(包涵體)、胞內(nèi)可溶性表示、細(xì)胞周質(zhì)表示，極少數(shù)情況下也可分泌到細(xì)胞外。不一樣表示形式含有不一樣表示水平及完全不一樣雜質(zhì)?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第21頁大腸桿菌表示外源基因優(yōu)勢全基因組測序，遺傳背景清楚（共4405

ORF）基因克隆表示系統(tǒng)成熟完善繁殖快速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA同意為安全基因工程受體生物缺點(diǎn)缺乏對真核生物蛋白質(zhì)復(fù)性功效缺乏對真核生物蛋白質(zhì)修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多內(nèi)毒素基因工程制藥培訓(xùn)第22頁（2）枯草芽孢桿菌分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包涵體；不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外因?yàn)樗泻軓?qiáng)胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進(jìn)行不一樣程度降解（3）鏈霉菌主要工業(yè)微生物。不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表示產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，含有一定糖基化能力基因工程制藥培訓(xùn)第23頁2、真核細(xì)胞（1）酵母特點(diǎn)：真核生物細(xì)胞，表示產(chǎn)物能糖基化；基因組小，僅為大腸桿菌4倍；世代時(shí)間短，繁殖快速；基因操作與原核生物相同；建立了有分泌功效表示系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對簡單。基因工程制藥培訓(xùn)第24頁（2）絲狀真菌特點(diǎn)：有很強(qiáng)蛋白分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯后加工，包含肽剪切和糖基化等;其糖基化方式與高等真核生物相同；絲狀真菌（如曲霉等）等被確認(rèn)是安全菌株，有成熟發(fā)酵和后處理工藝?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第25頁真核生物和原核生物基因表示過程示意圖基因工程制藥培訓(xùn)第26頁克隆載體:克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，使克隆DNA片段數(shù)量大大增加表示載體:將外源基因或DNA片段在宿主細(xì)胞中表示蛋白質(zhì)插入型載體:將外源基因或DNA插入其中置換型載體:切除載體部分DNA，代之以外源基因或DNA。載體（vector）基因工程制藥培訓(xùn)第27頁質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有、能獨(dú)立于寄主細(xì)胞染色體外而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳一類核酸分子。絕大多數(shù)質(zhì)粒是DNA型，天然DNA質(zhì)粒含有共價(jià)、封閉、環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA?；蚩寺≥d體質(zhì)粒DNA分子都含有復(fù)制子、選擇性標(biāo)識、克隆位點(diǎn)?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第28頁基因工程制藥培訓(xùn)第29頁原核細(xì)胞表示載體非融合型pKK223-3分泌型PINⅢ-ompA1

融合蛋白表示載體pGEX結(jié)構(gòu)包涵體型pBV220結(jié)構(gòu)

融合蛋白表示載體非融合型表示載體分泌型表示載體包涵體型表示載體基因工程制藥培訓(xùn)第30頁（一）表示載體表示載體必須具備條件：載體能夠獨(dú)立復(fù)制；含有靈活克隆位點(diǎn)和方便篩選標(biāo)識,且克隆位點(diǎn)應(yīng)在開啟子序列后，方便外源基因表示；含有很強(qiáng)開啟子，能為大腸桿菌RNA聚合酶識別；含有阻遏子，使開啟子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；含有很強(qiáng)終止子，使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆外源基因，而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)基因；所產(chǎn)生mRNA必須含有翻譯起始信號，即起始密碼AUG和SD序列，方便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第31頁（二）影響目標(biāo)基因在大腸桿菌中表示原因外源基因劑量外源基因表示效率：

A、開啟子強(qiáng)弱：將目標(biāo)基因插入大腸桿菌RNA聚合酶能識別強(qiáng)開啟子下游

B、核糖體結(jié)合位點(diǎn)有效性

C、SD序列和起始密碼間距

D、密碼子組成：設(shè)計(jì)引物或合成基因時(shí)選擇大腸桿菌“偏愛”密碼子基因工程制藥培訓(xùn)第32頁表示產(chǎn)物穩(wěn)定性：

A、組建融合蛋白；

B、利用信號肽將真核基因產(chǎn)物搬至周質(zhì)空隙中；

C、位點(diǎn)特異性突變，增加蛋白穩(wěn)定性；

D、采取蛋白酶缺點(diǎn)型大腸桿菌，減弱降解作用細(xì)胞代謝負(fù)荷：

A、宿主細(xì)胞生長與外源基因表示分開；

B、宿主細(xì)胞生長與重組質(zhì)粒復(fù)制分開；

C、形成不溶性包涵體工程菌培養(yǎng)條件基因工程制藥培訓(xùn)第33頁（三）真核基因在大腸桿菌中表示形式1.以融合蛋白形式表示藥品基因其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起，稱融合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，表示蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，不易被細(xì)菌酶類降解；易實(shí)現(xiàn)高效表示；缺點(diǎn)：有免疫原性，需切除原核多肽基因工程制藥培訓(xùn)第34頁2.以非融合蛋白形式表示藥品基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表示蛋白質(zhì)以真核蛋白mRNAAUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞；可能引發(fā)人體免疫反應(yīng)基因工程制藥培訓(xùn)第35頁3.分泌型表示蛋白藥品基因?qū)⑼庠椿蛉诤系骄幋a信號肽序列下游。慣用信號肽有：堿性磷酸酶信號肽；膜外周質(zhì)蛋白信號肽；霍亂弧菌毒素B亞單位；優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含甲硫氨酸殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或不在特定位置上切割?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第36頁酵母中基因表示（一）表示載體1.載體復(fù)制序列（1）YEp類（酵母附加體質(zhì)粒）（2）YRp類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）（3）YCp類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（4）YIp類（酵母整合型質(zhì)粒）基因工程制藥培訓(xùn)第37頁2.克隆載體向酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322ori部分和Ampr或Tetr部分，這么組成克隆載體同時(shí)帶有細(xì)菌和酵母復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)識。酵母慣用選擇性標(biāo)識：氨基酸或核苷酸合成酶系基因，對抑制酵母生長藥品含有抵抗力抗性基因基因工程制藥培訓(xùn)第38頁3.表示載體普通表示載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表示產(chǎn)物組成，尤其是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴(yán)格要求。準(zhǔn)確表示載體：要求在開啟子或前導(dǎo)肽編碼序列適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表示和加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多出氨基酸，也無缺失氨基酸。基因工程制藥培訓(xùn)第39頁（二）影響目標(biāo)基因在酵母菌中表示原因1.外源基因劑量：質(zhì)?？截悢?shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性2.外源基因表示效率：

A、開啟子

B、分泌信號效率

C、終止序列影響基因工程制藥培訓(xùn)第40頁3.外源蛋白糖基化4.宿主菌株影響：

A、菌體生長力強(qiáng)；

B、菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；

C、菌株性能穩(wěn)定；

D、分泌能力強(qiáng)基因工程制藥培訓(xùn)第41頁基因工程制藥培訓(xùn)第42頁基因工程菌培養(yǎng)基因工程制藥培訓(xùn)第43頁基因工程菌發(fā)酵基本操作方式有：

分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，取得菌體密度也有限

半連續(xù)培養(yǎng)（補(bǔ)料分批）在一次投料發(fā)酵基礎(chǔ)上，流加一定量營養(yǎng)，使細(xì)胞深入生長，或得到更多代謝產(chǎn)物連續(xù)培養(yǎng)不停地流加營養(yǎng)，并不停地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學(xué)特征和穩(wěn)定性等研究。

透析培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)方式基因工程制藥培訓(xùn)第44頁補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體深入生長培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，取得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補(bǔ)料辦法結(jié)合起來，依據(jù)基因工程菌生長規(guī)律來調(diào)整補(bǔ)料流加速率?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第45頁連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度到達(dá)一定程度后，開動進(jìn)料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)能夠?yàn)槲⑸锾峁┖愣ㄉ瞽h(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌發(fā)酵動力學(xué)、生理生化特征、環(huán)境原因?qū)虮硎居绊懙葎?chuàng)造了良好條件。

但因?yàn)榛蚬こ叹环€(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了處理這一問題，人們將工程菌生長階段和基因表示階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這么系統(tǒng)中關(guān)鍵控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細(xì)胞比生長速率。優(yōu)化這三個(gè)參數(shù)以確保在第一階段培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進(jìn)入第二階段后可取得最高表示水平或最大產(chǎn)率?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第46頁透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目標(biāo)是經(jīng)過去除培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌不利影響。采取膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動泵將發(fā)酵液抽出打入罐外膜透析器一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中乙酸濃度，并可經(jīng)過在透析液中補(bǔ)充養(yǎng)分而維持較適當(dāng)基質(zhì)濃度，從而取得高密度菌體。膜種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液百分比，透析液組成，循環(huán)流速，開始透析時(shí)間和透析培養(yǎng)連續(xù)時(shí)間段都對產(chǎn)物產(chǎn)率有影響基因工程制藥培訓(xùn)第47頁固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)一大難題是怎樣維持質(zhì)粒穩(wěn)定性。有些人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)覺基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒穩(wěn)定性大大提升，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，尤其是對分泌型菌更為有利。因?yàn)檫@一優(yōu)點(diǎn)，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到快速開展。基因工程制藥培訓(xùn)第48頁基因工程菌發(fā)酵中試

基因工程菌中試應(yīng)考慮問題：適宜商品化生產(chǎn)工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最正確化方法，工藝監(jiān)測方法，工藝控制方法，工藝自動化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法選擇，分離精制技術(shù)選擇。基因工程制藥培訓(xùn)第49頁基因工程菌不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性，兩種表現(xiàn)形式：

1）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，造成其表觀生物學(xué)功效喪失

2）分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸基因工程制藥培訓(xùn)第50頁基因工程菌不穩(wěn)定性可能產(chǎn)生機(jī)制：受體細(xì)胞中限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子降解外源基因高效表示嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常生長代謝

能量、物質(zhì)匱乏和外源基因表示產(chǎn)物毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成路徑，開啟降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配重組質(zhì)粒逃逸基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子缺失重排基因工程制藥培訓(xùn)第51頁培養(yǎng)基比生長速率限制性基質(zhì)溫度pH和溶氧外源基因表示遺傳特征

影響基因工程菌穩(wěn)定性原因載體選擇宿主選擇外源基因整合到宿主染色體上發(fā)酵工藝基因工程制藥培訓(xùn)第52頁1.培養(yǎng)基一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高質(zhì)粒穩(wěn)定性微生物在含有有機(jī)氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，因?yàn)榕囵B(yǎng)基提供了生長必須氨基酸和其它物質(zhì)，微生物生長較基本培養(yǎng)基快。

培養(yǎng)條件對基因工程菌穩(wěn)定性影響基因工程制藥培訓(xùn)第53頁2.比生長速率基因重組菌比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提升比生長速率有利于提升質(zhì)粒穩(wěn)定性?；蛑亟M菌比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，如溫度，pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定溫度和pH下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率主要原因。基因工程制藥培訓(xùn)第54頁3.限制性基質(zhì)普通培養(yǎng)基中各成份并不是完全平衡，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，微生物生長通常會受到一個(gè)或幾個(gè)物質(zhì)限制。限制性基質(zhì)種類對重組菌有不一樣影響4.pH和溶解氧pH和溶氧是影響微生物生長主要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時(shí)，通常都需要維持一定pH和溶氧水平。在基因重組菌高密度培養(yǎng)時(shí)，為了維持所需溶氧水平，除了提升攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入空氣中補(bǔ)充氧氣，以提升發(fā)酵罐供氧能力?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第55頁5.外源基因表示外源基因表示會引發(fā)重組質(zhì)粒不穩(wěn)定；尤其當(dāng)外源基因高效表示時(shí)，有可能因競爭利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細(xì)胞正常代謝活動，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。比如，吲哚丙烯酸（IAA）是trp

操縱子阻遏物部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌MV12（pVH5）時(shí)，在培養(yǎng)基中加入不一樣量IAA，發(fā)覺隨IAA量增加，pVH5帶有分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因表示水平有很大提升，同時(shí)比生長速率下降，培養(yǎng)液中Trp－

百分比上升。電泳分析表明60%～70%色氨酸合成能力喪失是因?yàn)橘|(zhì)粒結(jié)構(gòu)改變，其余是因?yàn)橘|(zhì)粒丟失造成?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第56頁1、改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目標(biāo)構(gòu)建方法包含：

1）將R1質(zhì)粒上parB

基因引入表示型載體中，其表示產(chǎn)物能夠選擇性地殺死因?yàn)榉峙洳痪鶆蛩a(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞

2）正確設(shè)置載體上多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)

3）將受體細(xì)胞致死性基因安裝在載體上，同時(shí)構(gòu)建條件致死性對應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌ssb

基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）

提升基因工程菌穩(wěn)定性策略基因工程制藥培訓(xùn)第57頁2、施加選擇壓力依據(jù)載體上抗藥性標(biāo)識，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加對應(yīng)抗生素藥品和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素；加入大量抗生素會使生產(chǎn)成本增加；添加一些輕易被水解失活抗生素，只能維持一定時(shí)間；添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力載體上營養(yǎng)缺點(diǎn)型標(biāo)識，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加對應(yīng)營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高

提升基因工程菌穩(wěn)定性策略基因工程制藥培訓(xùn)第58頁3、分階段控制培養(yǎng)因外源基因表示造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時(shí)，能夠考慮將發(fā)酵過程分階段控制在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，防止因表示造成不穩(wěn)定性問題發(fā)生；在取得需要菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表示。連續(xù)培養(yǎng)時(shí)能夠考慮采取多級培養(yǎng)，如在第一級進(jìn)行生長，維持菌體穩(wěn)定性，在第二級進(jìn)行表示。

提升基因工程菌穩(wěn)定性策略基因工程制藥培訓(xùn)第59頁4、控制目標(biāo)基因過量表示使用可控型開啟子控制目標(biāo)基因定時(shí)表示及表示程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒定時(shí)增殖或降低質(zhì)?？截悢?shù)5、優(yōu)化基因工程菌培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定

提升基因工程菌穩(wěn)定性策略基因工程制藥培訓(xùn)第60頁6、控制培養(yǎng)條件有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，因而采取間隙改變培養(yǎng)條件方法以改變這兩種菌比生長速率，從而改進(jìn)質(zhì)粒穩(wěn)定性。經(jīng)過間隙供氧方法和經(jīng)過改變稀釋速率方法都可提升質(zhì)粒穩(wěn)定性。比如研究表示干擾素大腸桿菌W3110(pEC901)在不一樣比生長速率下質(zhì)粒穩(wěn)定性，伴隨稀釋率增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性顯著增加，干擾素比效價(jià)也顯著增大.

提升基因工程菌穩(wěn)定性策略基因工程制藥培訓(xùn)第61頁7、固定化培養(yǎng)固定化能夠提升基因重組大腸桿菌穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進(jìn)行固定化后，質(zhì)粒穩(wěn)定性及目標(biāo)產(chǎn)物表示率都有了很大提升。在游離重組菌系統(tǒng)中慣用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒伎倆，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采取固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。不一樣宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性。

提升基因工程菌穩(wěn)定性策略基因工程制藥培訓(xùn)第62頁基因工程藥品分離純化基因工程制藥培訓(xùn)第63頁目標(biāo)產(chǎn)物在初始物料中含量較低；含目標(biāo)產(chǎn)物初始物料組成復(fù)雜，除目標(biāo)產(chǎn)物外，還有大量細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無機(jī)鹽等，尤其是產(chǎn)物類似物對目標(biāo)產(chǎn)物分離純化影響很大；目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，含有生物活性物質(zhì)對pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，輕易失活、變性；種類繁多，包含大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)雜又各異生物活性物質(zhì)；應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱原。基因工程藥品或生物技術(shù)產(chǎn)品特點(diǎn)基因工程制藥培訓(xùn)第64頁一、建立分離純化工藝需了解各種原因1.含目標(biāo)產(chǎn)物初始物料特點(diǎn)（1）菌種類型及其代謝特征（2）原材料和培養(yǎng)基起源及質(zhì)量是否穩(wěn)定（3）生產(chǎn)工藝和條件（4）初始物料物理、化學(xué)和生物學(xué)特征2.物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)3.目標(biāo)產(chǎn)物特征4.產(chǎn)品質(zhì)量要求基因工程制藥培訓(xùn)第65頁二、分離純化基本過程基因工程藥品分離純化主要分為5個(gè)步驟，包含細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品，以及成品加工?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第66頁

分離純化目標(biāo)產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。色譜技術(shù)分為：離子交換色譜

親和色譜凝膠過濾色譜高效液相色譜等三、重組蛋白質(zhì)分離純化基因工程制藥培訓(xùn)第67頁產(chǎn)物主要特征及在分離純化中作用基因工程制藥培訓(xùn)第68頁基因工程藥品生產(chǎn)中慣用分離純化方法基因工程制藥培訓(xùn)第69頁基因工程藥品制造實(shí)例干擾素是真核細(xì)胞對各種刺激作出反應(yīng)而自然形成一組復(fù)雜蛋白質(zhì)。干擾素除含有廣譜抗病毒活性，還含有抑制細(xì)胞分裂，尤其是抑制腫瘤細(xì)胞生長和免疫調(diào)整等功效，作為一個(gè)生物活性蛋白有著良好臨床應(yīng)用價(jià)值。干擾素在我國已經(jīng)同意上市基因工程藥品。早期取得方法：用病毒誘導(dǎo)人白血球(白細(xì)胞)產(chǎn)生，產(chǎn)量低，價(jià)格貴。300L人血才提取1mg

（一）干擾素基因工程制藥培訓(xùn)第70頁年抗非典期間，江南大學(xué)與麗珠集團(tuán)蘇州新寶制藥廠合作攻關(guān)，經(jīng)過發(fā)酵工程和生物制藥工程研制成功了重組人α-2b干擾素口鼻腔噴霧劑，處理了干擾素常溫保留穩(wěn)定性問題。在疫區(qū)特殊人群捐贈使用，效果顯著?；蚬こ讨扑幣嘤?xùn)第71頁誘生白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸↓經(jīng)過寡dT-纖維素柱提取mRNApBR322質(zhì)?！?%-23%蔗糖密度梯度離心提取12S-mRNA內(nèi)切酶切割↓↓由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA切割段位于β內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi)↓結(jié)果造成內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素雙鏈cDNA用末端Pst-I酶切割↓ 再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或者dG在pBR322質(zhì)粒DNA切割段加上dA或者dC++++++++++++++++

退火取得雜交質(zhì)粒

↓

轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12擴(kuò)增雜交質(zhì)粒

↓篩選能夠抗四環(huán)素、不過對氨芐青霉素敏感細(xì)菌克隆株↓采取雜交翻譯法挑選含有干擾素cDNA克隆

↓

將干擾素cDNA克隆進(jìn)表示載體

↓

在大腸桿菌中進(jìn)行高效表示↓（進(jìn)入下游工藝）工程菌構(gòu)建基因工程制藥培訓(xùn)第72頁工程菌發(fā)酵生產(chǎn)人干擾素a-2b基因工程菌為SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。

質(zhì)粒使用PL開啟子，含有氨芐青霉素抗性基因。

種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。

↓

基因工程菌接種到4個(gè)1000ml三角燒瓶之中，每個(gè)燒瓶內(nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)10小時(shí)，作為發(fā)酵罐種子。

↓

用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L

發(fā)酵培養(yǎng)基組成以下（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/ml氨芐青霉素、少許防泡沫劑。pH=6.8。）

↓

攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%

30℃發(fā)酵8小時(shí)（細(xì)菌增殖階段）

42℃誘導(dǎo)2-3小時(shí)（產(chǎn)物生產(chǎn)階段）