第六章親和層析

(AffinityChromatography)主講：蘇應(yīng)娟教授1968-1972年，Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。

概念：親和層析是利用配體和大分子相互作用時所固有的獨(dú)特的生物學(xué)特性建立的一種吸附層析。這種相互作用包括：酶—底物、產(chǎn)物、抑制物、輔酶和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑激素—結(jié)合蛋白、細(xì)胞受體基因—核酸、阻遏蛋白抗體—互補(bǔ)抗原植物外源性凝集素—紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的表面抗原、某些糖和多糖親和層析簡介第一節(jié)基本原理欲分離的大分產(chǎn)物質(zhì)S和相對應(yīng)的專一物質(zhì)L（配體）以次級鍵結(jié)合，能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)-S。其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價鍵首先結(jié)合，而形成M-L-S復(fù)合物。根據(jù)L-S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理發(fā)展起來的層析方法稱為親和層析法（AffinityChromatography）。專一性結(jié)合的力量（1）Hydrogenbond（2）

Hydrophobicinteraction（3）Electrostaticinteraction（4）Vanderwaalsinteraction+Kd+-=O…H-N-構(gòu)型互補(bǔ)所造成的吸引力VanderWaalinteractionsbetweennon-polarsurfacesvdwvdw范德華鍵數(shù)目夠多既足以造就親和力親和層析實質(zhì)是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M（如活化瓊脂糖等）上，制成親和吸附劑M-L，前者叫做固相載體，而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。當(dāng)把固相載體裝入小層析柱后，讓欲分離的樣品液通過該柱。樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S可借助靜電引力、范德華力及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質(zhì)被緩沖液洗滌出來，形成第一個層析峰。再改變緩沖液的pH值或增加離子強(qiáng)度或加入抑制劑等，可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，形成了第二個層析蜂。這樣就可把有效成分與雜質(zhì)分開。如果樣品液中存在兩個以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，采用選擇性緩沖液進(jìn)行洗脫，也可將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。分類1）特異性配體親和層析法。配體為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具較強(qiáng)的吸附選擇性和較大的結(jié)合力。2）通用性配體親和層析法。配體為簡單的小分于物質(zhì)（如金屬、染料以及氨基酸等），它成本低廉、且有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。優(yōu)點(diǎn)1）親和層析的分辨率高。因為將瓊脂糖基質(zhì)裝入上述的小層析柱中，不論加入何種樣品液都只能得到一個層析峰；2）操作步驟少，活力不易喪失。適用：分離純化蛋白質(zhì)，核酸和激素等物質(zhì)。缺點(diǎn)：要分離一種物質(zhì)必須找到適宜的配體，并將其制成固相載體。第二節(jié)

操作一、理想基質(zhì)的五點(diǎn)要求

1.極低的非特異吸附性。

2.高度的親水性。

親和吸附劑要易與水溶液中的生命大分子接近。

3.有較好的理化穩(wěn)定性。

當(dāng)配體固化和各種因素（如pH、離子強(qiáng)度、溫度和變性劑等）變化時，基質(zhì)很少甚至不受影響。

4.具有大量的化學(xué)基團(tuán)，能有效的被活化，而且容易和配體結(jié)合。

5.具有適當(dāng)?shù)亩嗫仔裕纯讖酱笮『秃Y孔多少）。根據(jù)分離物的性質(zhì)而定。當(dāng)分離物與配體親和力弱時，選用多孔性好的基質(zhì)可提高結(jié)合容量；當(dāng)分離物與配體親和力大、或者分離物呈顆粒狀或碎片狀時，則選用多孔性差的基質(zhì)對提高分離效果有利。親和吸附劑的基質(zhì)瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)葡聚糖纖維素交聯(lián)瓊脂糖多孔性的玻璃珠

（1）瓊脂糖商品名：Sepharose型號：2B，4B，6B型號含義：瓊脂糖濃度為2%，4%，6%特點(diǎn)：親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，網(wǎng)孔大，非專一性吸附小，但是只能以濕態(tài)保存，且經(jīng)不起有機(jī)溶劑處理。PartialStructureofAgaroseSepharose4B特點(diǎn)1）符合理想基質(zhì)的五點(diǎn)要求2）Sepharose極易用溴化氰活化3）易于引入不同的基團(tuán)，在溫和的條件下可連接較多的配體4）容易吸附大分子物質(zhì)，吸附量較大5）Sepharose4B的結(jié)構(gòu)比Sepharose6B的結(jié)構(gòu)疏松，機(jī)械強(qiáng)度比Sepharose2B好是親和層析中廣泛使用的基質(zhì)（2）聚丙烯酰胺凝膠商品名：Bio-GelP型號：P-100至-300型號含義：P后面的數(shù)字乘以1000為最大過濾限度特點(diǎn)：干膠，理化性質(zhì)穩(wěn)定，抗微生物侵襲能力較大，適用于配體和親和物之間親和力比較弱的系統(tǒng)，應(yīng)避免在pH2-11以外的溶液中長期使用。（3）葡聚糖凝膠商品名：Sephadex型號：G-100，150，200型號含義：SephadexG-X，X表示葡聚糖的交聯(lián)程度，數(shù)值越大則交聯(lián)度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以SephadexG-100為例，表示1克干燥的G-100凝膠可以吸水10ml。

特點(diǎn)：理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱耐堿，但是不耐酸，網(wǎng)孔小。其他基質(zhì)的特點(diǎn)商品纖維素具有不可忽略的吸附性，且結(jié)構(gòu)不均一。玻璃珠多孔性好、機(jī)械性能強(qiáng)，但對某些物質(zhì)也有一定的吸附力。交聯(lián)瓊脂糖由于交聯(lián)后降低了羧基數(shù)目，因而導(dǎo)致配體的結(jié)合數(shù)目減少。二、配體的選擇配體應(yīng)具備的特性：

對于欲純化的生物物質(zhì)應(yīng)具有專一親和性；具有與基質(zhì)共價結(jié)合的基團(tuán)選擇的配體。

可選擇的配體抑制劑效應(yīng)物酶的輔助因子類似底物抗體和其它物質(zhì)（如外源凝集素、染料和金屬離子等）各種配體分子及其對應(yīng)的親和性分子免疫吸附劑，大多自行合成單株抗體純化對a-D-葡萄糖、甘露糖基有專一性HeparinSepharoseCL-6B

BlueSepharoseCL-6B

5'AMP-，

2',5'ADP-Sepharose4B

用來純化lectin

酶的專一性結(jié)合Oligo(dT)-cellulose

配體

親和性分子說明（還有更多其它親和配體及介質(zhì)）

Oligo(dT)抗體基質(zhì)或抑制劑ProteinA、GConAHeparinCibacron-BlueAMP,ADP單糖及衍生物對應(yīng)之酶對應(yīng)之抗原LectinNAD(P)+結(jié)合酶

NAD(P)+結(jié)合酶

mRNA部分IgG糖蛋白凝血蛋白等優(yōu)良的配體應(yīng)具備兩個條件（1）大分子與配體的親和力

配體與互補(bǔ)大分子間的親和力，是選擇高效固定配體的一個重要因素。解離常數(shù)應(yīng)在10-4-10-8，當(dāng)>10-4時，親和力太低，不易成功分離，當(dāng)<10-8時，親和力太高，不易保持活性洗脫。式中，E為酶濃度，L為配體濃度，EL為酶-配體復(fù)合物，KL為解離常數(shù)=KL=

E0，L0為起始濃度，大多數(shù)情況下L0>>E0，L0>>EL，配體可以是小分子物質(zhì)：一些輔酶、輔基大分子物質(zhì)：酶、抗體純化酶的配體：底物、酶活性中心、抑制劑、輔酶、輔基等純化抗原抗體的配體：互為配體純化核酸的配體：DNA和RNA，蛋白質(zhì)和mRNAKL=

L0

，=

（2）具有與基質(zhì)共價結(jié)合的基團(tuán)該基團(tuán)和基質(zhì)結(jié)合后，對配體與互補(bǔ)蛋白的親和力沒有影響或影響不明顯。這對小分子的配體尤為重要，因為一個配體的解離常數(shù)即使很小，在其偶聯(lián)到基質(zhì)后，也可能由于結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致對大分子物質(zhì)的親和力大大降低，甚至完全喪失。所以事先要對配體的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究。三、

親和吸附劑的制備

將配體偶聯(lián)到基質(zhì)上的方法：物理法和化學(xué)法

物理法：包埋法和吸附法等

化學(xué)法：偶聯(lián)法和交聯(lián)法等

交聯(lián)法是用雙功能試劑（如戊二醛、碳化二亞胺）交聯(lián)基質(zhì)和配體。偶聯(lián)法的化學(xué)試劑溴化氰

環(huán)氧氯丙烷

雙環(huán)氧乙烯

丁二烯砜

亞氨二乙酸用其活化的基質(zhì)與配體偶聯(lián)，或用其把基質(zhì)和配體螯合起來。前兩種適合于含氨基的配體，后三種用于非生命分子的配體如重金屬等，但丁二烯砜偶聯(lián)法在堿性溶液中是不穩(wěn)定的。四、洗脫

（1）洗脫后可能出現(xiàn)的洗脫圖譜酶與雜質(zhì)一起流出

酶與雜質(zhì)沒有完全分離

酶與雜質(zhì)完全分開

（2）洗脫方法非特異性洗脫：改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)或溫度使物質(zhì)構(gòu)象改變，濃縮、洗脫后立即中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)迅速恢復(fù)到天然結(jié)構(gòu)特異性洗脫：再次利用生物學(xué)特異性只洗脫和配基專一作用的酶，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白（3）洗脫柱的再生當(dāng)洗脫結(jié)束后，連續(xù)用大量的洗脫液或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，再用平衡緩沖液使層析柱重新平衡。經(jīng)過這樣處理的柱子可再次上樣，進(jìn)行第二次親和層析。一般親和層析柱都可以反復(fù)使用多次。第三節(jié)提高吸附劑的操作容量影響操作容量的因素

1）配體性質(zhì)

2）配體在吸附劑中的含量

3）配體與吸附物結(jié)合時的位阻效應(yīng)大小

4）基質(zhì)的多孔性

5）操作條件一、在配體和基質(zhì)之間引入“手臂”（arms）1．原理

在配體和基質(zhì)之間特別是在小分子的配體和基質(zhì)之間引入適當(dāng)長度的“手臂”，使配體離開基質(zhì)的骨架，可以減少基質(zhì)的立體位阻效應(yīng)，增加配體的活動度及伸入溶液的深度，提高吸附劑的操作容量。2.

間隔臂的長度一般認(rèn)為，為了互補(bǔ)大分子獲得最佳相互作用，配體與骨架間必須插入至少4到6個亞甲基的臂。然而，當(dāng)互補(bǔ)大分子的分子量低或與配體的親和性較高時，則間隔臂長度不像大蛋白質(zhì)分子或低親和系統(tǒng)中那樣嚴(yán)格。目前還采用長鏈間隔分子，如聚賴氨酰丙氨酸，分子量約260,000，純化作用較短鏈強(qiáng)。3.

間隔臂的性質(zhì)惰性間隔分子：原認(rèn)為脂肪族碳?xì)浠衔锸嵌栊缘模菍嶒炞C明存在空間干擾和非特異吸附。親水性間隔分子：在長軸方向引入極性基團(tuán)，如二級胺、羥基、多肽等基團(tuán)這樣能極大降低非特異性吸附作用，但親和層析結(jié)果不好。疏水性間隔分子甘氨酸倍半肽（親水）對肝葡糖激酶吸附差

6-氨基乙酸（疏水）對肝葡糖激酶吸附好二、增加配體取代的程度

對解離常數(shù)較大的配體，增加配體在基質(zhì)上的濃度也可增加吸附劑結(jié)合量。增加配體數(shù)的方法：在配體量一定時，隨著基質(zhì)活性基團(tuán)的增加（通過活化時pH值的提高和溴化氰量的增加），偶聯(lián)配體的量也相應(yīng)增加。但當(dāng)基質(zhì)活化度太高時，由于位阻效應(yīng)，對大分子物質(zhì)配體的偶聯(lián)量會降低。因此，當(dāng)基質(zhì)活化度一定時，配體的偶聯(lián)量是隨著反應(yīng)液pH的增高或配體濃度的增高而增高的。三、配體和基質(zhì)以最少的鍵連接以蛋白質(zhì)和多肽為配體時，以最少的共價鍵連接到載體上，有利于保持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和其生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)是以游離氨基與溴化氰活化的瓊脂糖反應(yīng)的。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有較多的賴氨酸殘基，大部分ε-氨基暴露于整個分子的表面，當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)在pH＞9.5時，蛋白質(zhì)分會通過很多點(diǎn)與瓊脂糖偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)在不利的pH條件下（如pH7.0左右）進(jìn)行，就能減少蛋白質(zhì)分子與基質(zhì)連接的鍵。四、其它提高親和力的途徑除上述幾點(diǎn)外，樣品的濃度、pH、離子強(qiáng)度以及上樣的速度等因子對其有影響。若選擇得當(dāng)，則可提高固相載體對欲分離物的親和力。一般樣品的濃度低些，流速慢點(diǎn)或者讓樣品在柱中反應(yīng)一段時間，使欲分離的大分子物質(zhì)與配體之間有充分的碰撞機(jī)會，則吸附率＞95%。第四節(jié)親和層析的應(yīng)用及實例1.應(yīng)用范圍（1）用于解釋酶的作用機(jī)理（2）用于純化大分子物質(zhì)抗體、抗原及其結(jié)合物分子的純化融合了tag的基因重組蛋白的純化糖蛋白的純化含巰基蛋白的純化核酸的純化

在進(jìn)行酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究時，經(jīng)常使用專一的化學(xué)試劑改變酶的功能基團(tuán)。這種操作往往會引起酶活力的不完全喪失，但是難以確定具有的酶活力是代表殘留的天然酶活力？還是化學(xué)試劑作用后酶催化能力的變少？這就需要將具有活性和喪失活性的酶區(qū)分開后分別檢測才能確定。普通的方法很難將兩者區(qū)分。但是高分辨率的親和層析技術(shù)卻能夠做到這一點(diǎn)。（1）用于解釋酶的作用機(jī)理基團(tuán)的特異吸附劑：是對有關(guān)物質(zhì)的某一基團(tuán)，而不是單一物質(zhì)的親和。因此同一配體可用于純化若干物質(zhì)（例如酶系列），而不需要對每一個被純化的不同物質(zhì)準(zhǔn)備不同的吸附劑。基團(tuán)特異親和層析的特異性來自兩個方面，一是配體的選擇性，二是使用選擇性的洗脫條件。（2）純化大分子物質(zhì)常見的基團(tuán)特異吸附劑類型特異性(1)ProteinA、proteinG-瓊脂糖CL4BIgG和有關(guān)分子的Fc區(qū)(2)刀豆素A瓊脂糖末端–D-吡喃葡糖–D-吡喃甘露糖(3)小扁豆凝集素－瓊脂糖4B與刀豆素A瓊脂糖相似，但對簡單糖親和力低(4)小麥芽凝集素－瓊脂糖6MBN－乙酰－D－葡糖胺(5)poly(u)瓊脂糖4B核酸，特別是mRNA（含poly(A)系列poly(u)結(jié)合的蛋白）(6)poly(A)瓊脂糖4B核酸（含poly(u)系列），RNA特異蛋白(7)賴氨酸瓊脂糖4B血纖維蛋白溶酶原，核蛋白體RNA(8)藍(lán)瓊脂糖CL-6B有NAD+及NADP+輔基的酶；血清白蛋白(9)5'-AMP-瓊脂糖4B以NAD+為輔基和ATP依賴的酶(10)2'，5'-ADP-瓊脂糖4B以NADP+為輔基的酶親和層析法純化IgG類蛋白SPAorSPG瓊脂糖CL4BelutionIgGproteinIgGprotein

PurificationofmouseIgG2bfromascitesonHiTraprProteinAFF1mlcolumnusingasyringe.

PurificationofmonoclonalmouseIgG1onHiTrapProteinGHP,1ml.融合了tag的基因重組蛋白的純化

利用基因工程技術(shù)將目標(biāo)基因帶上一個標(biāo)簽-tag，這樣表達(dá)出來的帶特殊tag重組蛋白就能夠通過相應(yīng)的層析柱純化出來。這種親和層析技術(shù)與普通親和層析技術(shù)差別主要在以下兩步：

A:將目標(biāo)基因帶上tagNH2–proteintaglinkerDDDDKproteaseB:將目標(biāo)蛋白上的tag去除常用的各種分子標(biāo)簽TagMatrixElutingAgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,CobaltimidazoleorlowpH5-15HHHHHnativeordenaturing;inexpensiveresinFLAGanti-FLAGantibodylowpHorEDTA/EGTA8DYKDDDDKhighspecificity;harshelutioncond.StrepIImodifiedstreptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensiveresinS-peptideS-proteinenzymaticcleavage15KETAAAKFERHMDS