江南大學生物工程學院產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究1產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第1頁相關谷胱甘肽基本知識

生物活性三肽化合物小分子硫醇類化合物含有-肽鍵主要有還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形態(tài)2產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第2頁谷胱甘肽形態(tài)轉換

圖1-1酵母細胞中谷胱甘肽形態(tài)轉化過程

3產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第3頁谷胱甘肽在自然界中分布情況動物：肝臟、腎、紅細胞和眼睛晶狀體植物：蔬菜、豆類、谷物、薯類、菇類微生物：酵母（主要為Saccharomyces屬和Candida屬）

谷胱甘肽主要以GSH形式存在，大多數(shù)生物細胞中GSH與GSSG百分比約為100:1

。4產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第4頁谷胱甘肽功效

維持生物體內(nèi)適宜氧化還原環(huán)境

廣泛用于生物化學、醫(yī)學、生物學和化學研究測定

GSH能夠快速增強機體免疫力

對消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和新陳代謝等都有很大幫助

GSH含有消除疲勞作用近年來還發(fā)覺GSH含有抑制艾滋病病毒功效

加拿大麥基爾大學教授古特曼博士這么預測：“GSH很快就會象膽固醇一樣深入民心，成為人們衡量健康指標之一”。5產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第5頁

GSH多用于治療肝臟疾病解毒抗輻射抗腫瘤、癌癥抗氧化衰老協(xié)調(diào)內(nèi)分泌療效顯著且無副作用，這些同類藥品所不含有優(yōu)點使得GSH在臨床醫(yī)藥領域有著極為廣泛用途。谷胱甘肽應用于臨床6產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第6頁表1-1GSH生理功效及其在臨床上應用7產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第7頁谷胱甘肽應用于食品行業(yè)GSH含有獨特生理功效，被稱為長壽因子和抗衰老因子

GSH在強化食品風味同時對人體有保健作用它在食品行業(yè)應用前景顯然要優(yōu)于其它類型防腐劑或抗氧化劑表1-2GSH在食品加工業(yè)中用途

8產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第8頁谷胱甘肽應用前景醫(yī)藥工業(yè)食品工業(yè)體育運動生物研究GSH有一個巨大市場研究興趣日益增加需求量不停增加昂貴市場價格GSH在各領域中廣泛應用限制9產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第9頁谷胱甘肽制備方法

有機溶劑萃取法化學合成法生物技術法

酶轉化法

發(fā)酵法10產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第10頁酶法合成谷胱甘肽

谷胱甘肽合成酶系酶活提升

ATP再生系統(tǒng)構建

E.coli細胞中乙酸激酶反應

S.cerevisiae細胞中糖酵解路徑

固定化酶（細胞）技術應用

提升ATP轉移效率以及增加ATP在反應體系中穩(wěn)定性，以實現(xiàn)ATP再生系統(tǒng)高效運行。11產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第11頁發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽

高產(chǎn)菌株選育發(fā)酵過程優(yōu)化及控制

基因工程菌在谷胱甘肽生產(chǎn)中應用12產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第12頁高產(chǎn)菌株選育

圖1-3高產(chǎn)GSH酵母菌株選育方法與結果

13產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第13頁發(fā)酵條件優(yōu)化

營養(yǎng)成份選擇培養(yǎng)條件優(yōu)化發(fā)酵過程控制

控制葡萄糖濃度：流加發(fā)酵控制細胞比生長速率：提升比GSH合成速率前體物質(zhì)添加添加策略：一次性添加、連續(xù)添加等發(fā)酵過程優(yōu)化及控制14產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第14頁基因工程技術應用

提升GSH合成酶系酶活：增加質(zhì)?？截悢?shù)降低酶系對GSH敏感性：構建脫敏菌株

！需要考慮質(zhì)粒穩(wěn)定性！15產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第15頁發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究中仍存在問題

對C.utilis發(fā)酵生產(chǎn)GSH細胞生長規(guī)律和GSH合成特征還缺乏了解還沒有發(fā)覺從發(fā)酵動力學角度，來分析并取得GSH發(fā)酵過程中出現(xiàn)規(guī)律性結果

在流加發(fā)酵中，高細胞密度和高GSH合成能力矛盾還沒有處理未見利用代謝理論及其伎倆為GSH合成過程中發(fā)生改變尋求合理解釋怎樣將胞內(nèi)GSH分泌至胞外也需要深入研究16產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第16頁發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究意義

日本協(xié)和發(fā)酵和味之素企業(yè)在上世紀80年代就已實現(xiàn)GSH工業(yè)化生產(chǎn)，并基本壟斷國際市場我國在該方面研究相對滯后日本以顯著差價將GSH銷往歐美和我國（歐美250美元/kg，我國450美元/kg）所以，大力研制開發(fā)并取得含有自主知識產(chǎn)權GSH生產(chǎn)技術，對于我國功效食品和醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展都含有主要意義。17產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第17頁發(fā)酵過程優(yōu)化原理外因：基于微生物反應原理培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術內(nèi)因：基于代謝特征分階段培養(yǎng)技術外因定量化：基于動力學模型分析優(yōu)化和控制技術內(nèi)因定量化：基于代謝通量分析過程優(yōu)化技術18產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第18頁微生物細胞基于微生物反應原理培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(外因）創(chuàng)造一個適于微生物生長和代謝環(huán)境關鍵技術1在一個生物反應體系中19產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第19頁基于代謝特征分階段培養(yǎng)技術(內(nèi)因）基于微生物反應原理培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(外因）創(chuàng)造一個適于微生物生長和代謝環(huán)境關鍵技術2在一個生物反應體系中控制細胞代謝特征，與優(yōu)化環(huán)境相適應20產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第20頁基于代謝特征分階段培養(yǎng)技術(內(nèi)因）基于動力學模型分析優(yōu)化和控制技術(外因，定量化）關鍵技術3在一個生物反應體系中控制細胞代謝特征，與優(yōu)化環(huán)境相適應基于微生物反應原理培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(外因）21產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第21頁基于代謝特征分階段培養(yǎng)技術(內(nèi)因）基于動力學模型分析優(yōu)化和控制技術(外因，定量化）關鍵技術4在一個生物反應體系中基于微生物反應原理培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(外因）基于代謝通量分析過程優(yōu)化技術(內(nèi)因，定量化）22產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第22頁本研究主要內(nèi)容

課題起源：江蘇省高校高新技術產(chǎn)業(yè)發(fā)展項目“微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽”研究目標：酵母細胞和GSH高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強度研究內(nèi)容：（6個部分）產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響23產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第23頁產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件

谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響

24產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第24頁碳源種類對谷胱甘肽發(fā)酵影響

表2-1各種碳源對細胞生長及GSH合成影響

25產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第25頁圖2-2糖類碳源對細胞生長及GSH合成影響

■

Glucose;○Sucrose;◆Fructose26產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第26頁氮源種類對谷胱甘肽發(fā)酵影響

圖2-3各種氮源對細胞生長及GSH合成影響

□

Beefextract;●Peptone;▲Yeastextract;■Urea;○(NH4)2SO4;◆NH4Cl;

NaNO3

27產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第27頁混合氮源對谷胱甘肽發(fā)酵影響

圖2-4混合氮源（硫酸銨+尿素）對細胞生長及GSH合成影響

Mixednitrogensourceconcentration:■6g·L-1;○8g·L-1;▲10g·L-1

28產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第28頁KH2PO4和MgSO4對谷胱甘肽發(fā)酵影響

圖2-5不一樣濃度磷酸二氫鉀和硫酸鎂對GSH生物合成影響■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent

29產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第29頁谷胱甘肽發(fā)酵營養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗

表2-2L16(45)正交試驗原因水平表

30產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第30頁表2-3正交試驗數(shù)據(jù)及BP神經(jīng)網(wǎng)絡處理結果31產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第31頁圖2-6正交試驗結果直觀分析

■

GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent

以提升GSH產(chǎn)量為目標（即Y2最大化），經(jīng)過直觀分析圖取得較優(yōu)化營養(yǎng)條件組合為A2B3C2D4E2，即葡萄糖濃度30g·L-1，(NH4)2SO4濃度4g·L-1，尿素濃度4g·L-1，KH2PO4濃度3g·L-1，MgSO4濃度0.25g·L-1。這與BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測結果是一致。32產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第32頁環(huán)境條件對谷胱甘肽發(fā)酵影響

圖2-7環(huán)境條件對C.utilisWSH02-08細胞生長及GSH合成影響■

GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent33產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第33頁

C.utilisWSH02-08

生產(chǎn)谷胱甘肽搖瓶發(fā)酵過程

圖2-8C.utilisWSH02-08搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GSH過程曲線●

Residualglucose;

pH;■GSHconcentration;○DCW;△GSHcontent34產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第34頁搖瓶分批補糖方式對谷胱甘肽發(fā)酵影響

表2-4搖瓶中不一樣補糖方式對GSH發(fā)酵影響

35產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第35頁本章小結：1、確定了C.utilisWSH02-08發(fā)酵生產(chǎn)GSH培養(yǎng)基營養(yǎng)成份及其濃度組合；2、以實現(xiàn)細胞高產(chǎn)和GSH高合成為目標，取得了較優(yōu)環(huán)境條件組合；3、搖瓶發(fā)酵結果表明，DCW最大值達9.0g·L-1，GSH最大濃度

208.3mg·L-1，胞內(nèi)GSH含量2.35%；4、總糖濃度固定情況下，適當補糖策略對GSH合成有一定促進作用。36產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第36頁

產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件

谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學

流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響

37產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第37頁溶氧對谷胱甘肽分批發(fā)酵影響圖3-1不一樣攪拌轉速下發(fā)酵過程溶氧改變趨勢1—350r·min-1;2—300r·min-1;3—250r·min-1;4—200r·min-1

38產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第38頁圖3-2不一樣攪拌轉速下GSH分批發(fā)酵過程◆

200r·min-1;■250r·min-1;

△300r·min-1;

○350r·min-1

39產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第39頁不控制pH谷胱甘肽發(fā)酵過程圖3-3不一樣pH控制方式下

GSH發(fā)酵過程曲線□

glucose;■DCW;▲extracellularGSH;△intracellularGSH;○pH;◆totalGSH;●intracellularGSHcontent;PanelA-C,nopHcontrol;PanelD-F,pH5.5發(fā)覺低pH培養(yǎng)環(huán)境下，產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)合成GSH大量向胞外滲漏40產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第40頁控制恒定pH時谷胱甘肽發(fā)酵過程圖3-4不一樣恒定pH條件下GSH發(fā)酵各過程參數(shù)比較

□

DCW;■

PGSH;

μ;◆

qP;△GSHcontent;▲GSHconcentration;○

YX/S;●

YP/S

41產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第41頁基于動力學模型解析pH對谷胱甘肽發(fā)酵影響表3-2不一樣pH下GSH分批發(fā)酵動力學參數(shù)模擬結果

KI表示底物濃度對細胞生長抑制程度，且KI值越高則抑制效應越低。

42產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第42頁圖3-5不一樣pH條件下GSH合成能力及細胞生長比較

pH為5.5時GSH總量到達最大，從動力學角度分析，是因為在這一pH下兼具了KI值高（底物對細胞生長抑制效應?。?、α值低和β值高（細胞生長過程中和生長結束后均可保持較高比GSH合成速率）特點。α為直線斜率，表示在μ相同條件下，細胞合成GSH能力強弱；β為截距，反應生長停頓后（μ=0）細胞繼續(xù)合成GSH能力高低。

43產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第43頁不一樣溫度下谷胱甘肽發(fā)酵過程分析圖3-6不一樣溫度條件下GSH發(fā)酵過程及動力學參數(shù)隨時間改變情況●

andcurve1,32oC;□andcurve2,30oC;▲andcurve3,28oC;○andcurve4,26oC;△andcurve5,24oC44產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第44頁表3-3不一樣溫度條件下GSH分批發(fā)酵過程參數(shù)比較

45產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第45頁細胞生長動力學模型及其參數(shù)預計表3-4不一樣溫度下細胞生長動力學參數(shù)模擬結果

46產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第46頁谷胱甘肽合成動力學模型及其參數(shù)預計表3-5不一樣溫度下GSH合成動力學參數(shù)模擬結果

47產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第47頁圖3-7溫度對C.utilisWSH02-08細胞生長動力學參數(shù)影響及其模擬

不一樣溫度和葡萄糖濃度下細胞濃度隨時間改變情況：48產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第48頁圖3-8C.utilisWSH02-08細胞生長動力學模型驗證A:Temperature29oC,initialglucoseconcentration28.3g·L-1B:Temperature30oC,initialglucoseconcentration33.2g·L-1

49產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第49頁分階段溫度控制策略提出與實現(xiàn)表3-8不一樣溫度下分批發(fā)酵8h前后平均比生長速率和平均比GSH合成速率比較結果

50產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第50頁圖3-9分階段溫度控制策略下GSH發(fā)酵過程曲線◆

Glucose;○GSH;▲DCW51產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第51頁表3-3不一樣溫度條件下GSH分批發(fā)酵過程參數(shù)比較

52產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第52頁本章小結：1、在滿足細胞生長范圍內(nèi)，溶氧對胞內(nèi)GSH含量影響不大。在葡萄糖濃度為30g·L-1且通氣量1.2vvm情況下，將攪拌轉速恒定在300r·min-1即可滿足細胞生長和GSH合成對溶解氧需求；2、不控制pH時，發(fā)酵液pH快速下降，至pH1.5時胞內(nèi)合成GSH開始向胞外滲漏，最終DCW和GSH產(chǎn)量比pH5.5時發(fā)酵結果分別低27%和95%，且GSH胞外滲漏量約占GSH合成總量50%；3、在pH4.0~6.5范圍內(nèi)，pH5.5時最有利于GSH合成。從分批發(fā)酵動力學角度進行分析，解釋了pH對細胞生長和GSH合成影響這一生理學現(xiàn)象；53產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第53頁4、在24oC~32oC范圍內(nèi)，較高溫度對C.utilisWSH02-08細胞生長有促進作用，而較低溫度更有利于GSH合成；5、依據(jù)細胞生長動力學參數(shù)，得到24oC~32oC范圍內(nèi)GSH分批發(fā)酵過程中細胞濃度同溫度以及底物濃度之間普通關系式：驗證試驗結果表明，該模型在24oC~32oC范圍內(nèi)可用于預測不一樣溫度下細胞生長情況；6、提出分階段溫度控制策略：發(fā)酵起始溫度30oC，8h后切換至26oC并保持到發(fā)酵結束。結果表明，分階段溫度控制策略實施能夠深入提升GSH合成能力，其中GSH產(chǎn)量分別比在26oC和30oC時提升了5%和23%，而胞內(nèi)GSH含量更是高達2.61%。所以，該策略含有很好實用性。

54產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第54頁

產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽

前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響55產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第55頁初糖濃度對谷胱甘肽分批發(fā)酵影響圖4-1不一樣初糖濃度下GSH發(fā)酵過程○

17.2g·L-1;■25.2g·L-1;△33.2g·L-1;●41.8g·L-1;□49.9g·L-1

56產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第56頁表4-1不一樣初糖濃度下GSH發(fā)酵過程參數(shù)比較

57產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第57頁分批補料培養(yǎng)生產(chǎn)谷胱甘肽發(fā)酵過程圖4-2分批補料培養(yǎng)方式下GSH發(fā)酵過程■

Glucose;○DCW;●GSH;△GSHcontent58產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第58頁恒速流加發(fā)酵對谷胱甘肽生產(chǎn)影響圖4-3葡萄糖恒速流加下

GSH發(fā)酵過程■

Glucose;○DCW;●GSH;△GSHcontent;A-B,4.2g·L-1·h-1;C-D,5.0g·L-1·h-1;E-F,6.4g·L-1·h-1

59產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第59頁指數(shù)流加發(fā)酵對谷胱甘肽生產(chǎn)影響圖4-4葡萄糖指數(shù)流加培養(yǎng)下GSH發(fā)酵過程■

Glucose;○DCW;●GSH;△GSHcontent60產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第60頁不一樣培養(yǎng)方式下谷胱甘肽生產(chǎn)情況比較表4-2不一樣培養(yǎng)方式下細胞生長和GSH合成過程參數(shù)比較

aFed-batch(1),(2),(3)wererepresentativeforglucosefeedingatconstantrateof4.2g·L-1·h-1,5.0g·L-1·h-1and6.4g·L-1·h-1,respectively,whileFed-batch(4)wasrepresentativeforthecultivationmodeofglucosefeedingataexponentialrate.b

qPreferstospecificGSHproductionrate.61產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第61頁本章小結：1、不一樣葡萄糖濃度下試驗結果表明，僅經(jīng)過分批培養(yǎng)難以實現(xiàn)細胞和GSH

高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強度有機統(tǒng)一；2、分批補料、恒速流加和指數(shù)流加等幾個培養(yǎng)方式都能夠?qū)崿F(xiàn)酵母細胞和

GSH高產(chǎn)量，其中指數(shù)流加還能夠同時提升細胞和GSH生產(chǎn)強度。經(jīng)過48h指數(shù)流加培養(yǎng)，DCW到達40.9g·L-1，GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量均到達最大值857.2mg·L-1和2.25%。

62產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第62頁

產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件

谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用

谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響

63產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第63頁L-谷氨酸添加對谷胱甘肽發(fā)酵影響圖5-1L-谷氨酸添加對GSH發(fā)酵影響●

0h;□6h;■12h;○16h64產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第64頁甘氨酸添加對谷胱甘肽發(fā)酵影響圖5-2甘氨酸添加對GSH發(fā)酵影響●

0h;□6h;■12h;○16h65產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第65頁L-半胱氨酸添加對谷胱甘肽發(fā)酵影響圖5-3L-半胱氨酸對GSH搖瓶發(fā)酵影響○

0h;■4h;▲8h;□12h;●16h66產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第66頁分批發(fā)酵中L-半胱氨酸對谷胱甘肽過量合成作用圖5-4L-半胱氨酸對分批發(fā)酵過量合成GSH影響●

Glucose;○DCW;■GSH;□Residualthiols;▲Totalthiol;△GSHcontent;A-B,添加8mmo/LL－Cys;C-D,添加16mmo/LL－Cys

67產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第67頁流加發(fā)酵中添加L-半胱氨酸促進谷胱甘肽合成圖5-5L-半胱氨酸對流加發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)GSH影響●

Glucose;○DCW;■GSH;□Residualthiols;▲Totalthiol;△GSHcontent68產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第68頁L-半胱氨酸對不一樣培養(yǎng)方式下GSH生產(chǎn)影響比較表5-1L-半胱氨酸添加對不一樣培養(yǎng)方式下GSH合成影響

aAverageqPherereferstotheaveragespecificGSHproductionrateafterL-cysteineaddition.bAverageqPherewasrepresentativefortheaveragespecificGSHproductionrateofthewholeprocess.69產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第69頁本章小結：1、L-谷氨酸和甘氨酸在細胞不一樣生長階段添加對GSH發(fā)酵過程并無太大影響，L-半胱氨酸即使對細胞生長有抑制作用，但能夠大幅度提高GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量；2、對于分批發(fā)酵來說，在L-半胱氨酸添加前后，GSH合成量約各占總量50%，對于流加發(fā)酵，最終GSH產(chǎn)量能夠高達1150mg·L-1；3、總體上來看，L-半胱氨酸對GSH發(fā)酵影響主要表現(xiàn)在GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量提升幅度上，以及添加前后GSH平均比合成速率改變差異上。70產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第70頁

產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件

谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析

表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響

71產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第71頁代謝工程概念起源于上世紀90年代初，實質(zhì)是對細胞代謝通量及其控制進行定量分析，并對代謝進行合理改造，以最大程度提升目標代謝產(chǎn)物產(chǎn)率包括生理學、分子生物學、生物化學及生物路徑工程學等多門學科慣用定量方法有代謝控制分析、代謝通量分析、生化系統(tǒng)理論、路徑分析、控制論模型等代謝通量分析模型（MFA）是代謝工程基礎研究中最主要計算代謝路徑中各物質(zhì)通量伎倆MFA假定細胞內(nèi)物質(zhì)、能量處于擬穩(wěn)態(tài)，在測定胞外代謝物濃度和菌體組成基礎上，依據(jù)物料平衡和已知代謝路徑計算細胞內(nèi)代謝通量代謝工程基本知識72產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第72頁圖6-1C.utilisWSH02-08分批培養(yǎng)合成GSH代謝網(wǎng)絡結構模型

73產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第73頁代謝通量計算

代謝通量分析（MFA）最主要基礎是擬穩(wěn)態(tài)假設

采取化學計量方程對各代謝物質(zhì)量平衡進行計算

A·r=X

計算標準

1、矩陣A中元素確實定遵照“反應為負，生成為正”和“1C-mol基準”標準；

2、代謝物通量都是以消耗葡萄糖比速率為基準相對碳摩爾通量，葡萄糖攝入（r1）以100計。

74產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第74頁圖6-2GSH分批發(fā)酵第一階段代謝通量分布（0~6h）

75產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第75頁圖6-2GSH分批發(fā)酵第二階段代謝通量分布（6~14h）

76產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第76頁5.6圖6-2GSH分批發(fā)酵第三階段代謝通量分布（14~30h）

77產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第77頁5.3圖6-3分階段溫度控制策略下GSH分批發(fā)酵第三階段代謝通量分布78產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第78頁5.0圖6-4L-半胱氨酸添加后GSH分批發(fā)酵第三階段代謝通量分布79產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第79頁本章小結：1、分析了C.utilisWSH02-08細胞生物合成GSH代謝網(wǎng)絡，發(fā)覺在分批發(fā)酵前期，HMP路徑代謝活躍，為細胞生物合成提供足夠NADPH；在發(fā)酵中后期，EMP路徑和TCA循環(huán)代謝加強，產(chǎn)生更多NADH和FADH2進入呼吸鏈被氧化而產(chǎn)生ATP以供給細胞代謝維持需要；2、溫度切換（30oC→26oC）使更多NADPH參加到CYS合成成為可能，而經(jīng)過SER進入CYS碳通量增加，直接結果是流向GC和GSH碳通量增加，因而提升了GSH產(chǎn)量；3、L-半胱氨酸添加使HMP路徑近似于關閉，碳通量直接進入EMP路徑和

TCA循環(huán)，同時外加L-半胱氨酸使經(jīng)過CYS碳通量大增，最終GSH產(chǎn)量提升快要1倍。

80產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第80頁

產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽營養(yǎng)及環(huán)境條件

谷胱甘肽分批發(fā)酵生產(chǎn)及其動力學流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽前體氨基酸在谷胱甘肽過量合成中作用谷胱甘肽分批發(fā)酵過程代謝網(wǎng)絡分析表面活性劑對谷胱甘肽胞外積累影響

81產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第81頁表面活性劑對細胞生長影響圖7-1不一樣類型表面活性劑對細胞生長影響

82產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第82頁低濃度離子型表面活性劑對谷胱甘肽合成影響圖7-2低濃度離子型表面活性劑對GSH合成影響●

IntracellularGSH;○ExtracellularGSH；■

TotalGSH；□

GSHcontent83產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第83頁高濃度離子型表面活性劑對GSH胞外積累影響圖7-3高濃度離子型表面活性劑對GSH胞外積累影響●

ExtracellularGSH;○IntracellularGSH;▲DCW;△GSHcontent;■TotalGSH;□TGSH/DCW8h;┄┄16h;──24h84產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第84頁非離子型表面活性劑對谷胱甘肽合成影響圖7-4非離子型表面活性劑對GSH胞外積累影響■,□IntracellularGSH;▲,△ExtracellularGSH;●,○TotalGSH;

◆,

TGSH/DCW;┄┄0h;──16h85產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第85頁本章小結：1、離子型表面活性劑SDS和CTAB對酵母細胞生長存在臨界濃度現(xiàn)象，醚類非離子表面活性劑Brij30只有在高濃度時才對細胞生長產(chǎn)生部分抑制，而酯類非離子表面活性劑Tween80對細胞生長幾乎沒有負面影響；2、低于臨界濃度離子型表面活性劑影響了酵母細胞GSH合成能力，但不能促進GSH向胞外積累；高于臨界濃度時，對于培養(yǎng)后期酵母細胞內(nèi)

GSH胞外分泌含有主動作用；3、Brij30在一定濃度下對細胞生長和GSH合成表現(xiàn)出與離子型表面活性劑相似特點，但對GSH胞外積累貢獻不大；Tween80對GSH發(fā)酵過程以及酵母細胞合成GSH能力幾乎沒有影響。86產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第86頁結論(1)以C.utilisWSH02-08作為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH出發(fā)菌株。在單原因試驗基礎上，采取L16(45)正交表安排發(fā)酵培養(yǎng)基中各營養(yǎng)組分及其濃度正交優(yōu)化試驗，結合BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測，得到以提升GSH產(chǎn)量為目標營養(yǎng)條件組合為：葡萄糖30g·L-1，(NH4)2SO44g·L-1，尿素4g·L-1，KH2PO43g·L-1，

MgSO40.25g·L-1。深入取得了GSH搖瓶發(fā)酵較優(yōu)環(huán)境條件組合為：初始

pH6.0、裝液量50mL/500mL、接種量10%。(2)

在C.utilisWSH02-08發(fā)酵生產(chǎn)GSH搖瓶培養(yǎng)過程中，26h時DCW達最大值

9.0g·L-1，28h時GSH積累至最大濃度208.3mg·L-1，胞內(nèi)GSH含量2.35%。在總糖濃度固定情況下，適當搖瓶補糖方式對GSH合成含有促進作用，最多能夠提升GSH產(chǎn)量約10%，胞內(nèi)GSH含量也高達2.52%。87產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽研究第87頁(3)

在7L攪拌式發(fā)酵罐中進行C.utilisWSH02-08分批培養(yǎng)生產(chǎn)GSH，攪拌轉速對胞內(nèi)GSH含量影響較小。所以，當葡萄糖濃度為30g·L-1且通氣量控制在

1.2vvm時，攪拌轉速只要不低于300r·min-1即可滿足細胞生長和GSH合成對溶解氧需求。(4)

不一樣pH