熒光原位雜技技術(shù)及其臨床應(yīng)用第1頁/共50頁由細(xì)胞到DNA分子第2頁/共50頁熒光原位雜交技術(shù)的基本概念

1.脫氧核糖核酸(DNA)分子2.脫氧核糖核酸(DNA)探針3.脫氧核糖核酸(DNA)變性4.脫氧核糖核酸(DNA)雜交第3頁/共50頁熒光原位雜交原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。第4頁/共50頁熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)（簡稱FISH）是用細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的原理，通過熒光標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)的核酸序列雜交。借助熒光顯微鏡，在細(xì)胞和（或）組織中觀察并分析細(xì)胞內(nèi)雜交于靶序列的多種彩色探針信號(hào)，以獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體或多種基因狀態(tài)的信息。第5頁/共50頁熒光原位雜交示意圖第6頁/共50頁常見的熒色物熒色物激發(fā)（nm）散發(fā)（nm）DAPI達(dá)比350470FITC異氰酸熒光素490525TexasRed德克莎斯紅顏料596615第7頁/共50頁熒光顯微鏡系統(tǒng)第8頁/共50頁探針的標(biāo)記的種類及比較

1.探針標(biāo)記方法主要有兩類：（1）直接標(biāo)記法，就是熒光素通過一些方法直接連接到核酸序列上。（2）間接標(biāo)記法，就是把地高辛或生物素等半抗原連接到核酸序列，然后在雜交過后的檢測(cè)階段，加入標(biāo)記有熒光素的相應(yīng)半抗原抗體參與反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

第9頁/共50頁探針的標(biāo)記的種類及比較2.這兩種標(biāo)記方法相比較而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低，信號(hào)強(qiáng)度不及間接法強(qiáng)；間接法具有信號(hào)放大系統(tǒng)，信號(hào)強(qiáng)檢測(cè)靈敏度高，但是間接法雜交過后檢測(cè)步驟繁瑣，背景信號(hào)強(qiáng)。近年來熒光的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高,直接標(biāo)記的熒光探針越來越成為首選,并采用多種不同顏色的熒光,方便在同一標(biāo)本上同時(shí)檢測(cè)多種異常.其熒光強(qiáng)度和信號(hào)大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察,操作過程中也不需要嚴(yán)格避光,鑒于直接標(biāo)記法已經(jīng)可以獲得較滿意的信號(hào)，目前臨床檢測(cè)用的探針多為直接標(biāo)記法標(biāo)記。第10頁/共50頁臨床常用的探針

臨床使用的探針都是以DNA為主。常用探針主要有：（1）著絲粒探針。CEP:ChromosomeEnumerationDNAProbes（2）位點(diǎn)特異型探針。LSI:Locusspecificidentifier（3）染色體涂染探針。WCP:WholeChromosomePaints第11頁/共50頁著絲粒探針a.高度重復(fù)序列DNA,重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，其靶序列通常是在染色體的p11-q11區(qū)域及異染色質(zhì)區(qū)域。

b.特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)

c.應(yīng)用(a)標(biāo)記染色體識(shí)別。

(b)染色體數(shù)目異常檢測(cè)。

(c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷。

第12頁/共50頁著絲粒探針染色體的著絲粒異染色質(zhì)域第13頁/共50頁位點(diǎn)特異型探針

a.標(biāo)記了熒光信號(hào)的DNA片段代表了某一個(gè)或幾個(gè)基因位點(diǎn)的全部序列。主要用以染色體DNA克隆序列的定位和靶DNA序列拷貝數(shù)及結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)。

b.特點(diǎn)：信號(hào)較小。

c.應(yīng)用:

（a）定位DNA片段。

（b）確定染色體微小缺失與重復(fù)。

（c）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。第14頁/共50頁16號(hào)和22號(hào)染色體探針信號(hào)位點(diǎn)特異型探針第15頁/共50頁染色體涂染探針a.涂染探針是針對(duì)某一整條染色體設(shè)計(jì)探針，涂染探針主要用于常規(guī)顯帶技術(shù)無法確定的染色體重排和標(biāo)記染色體的確定。能對(duì)整條染色體進(jìn)行熒光標(biāo)記b.特點(diǎn)：結(jié)果容易判讀。然而，整條染色體涂染探針不能分辨同一染色體臂間易位及染色體倒位。c.應(yīng)用：（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析。

（2）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。第16頁/共50頁染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分析第17頁/共50頁FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟1）備制玻片2）標(biāo)本變性3）探針變性4）雜交5）DAPI復(fù)染5）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果第18頁/共50頁羊水標(biāo)本采集a.在B超腹部探頭引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺，抽

取羊水20ml，其中15ml用于常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng),5ml用于FISH檢測(cè)。第19頁/共50頁未培養(yǎng)羊水細(xì)胞制片

取羊水5ml，1800rpm離心棄上清，加1mg/mlHank's膠原酶B5ml，37℃水浴30min，1800rpm離心去上清，加0.075MKCl5ml，37℃水浴低滲20min，加甲醇:乙酸=3∶1固定液2ml預(yù)固定，1800rpm離心去上清，加5ml固定液輕輕混勻，固定10min，1800rpm離心去上清，再重復(fù)固定1次，制成細(xì)胞懸液，滴片備用。第20頁/共50頁雜交前預(yù)處理

將玻片于2×SSC溶液中浸泡10min，然后放入0.1MHCl浸泡10min，再放入2×SSC溶液中浸泡5min，然后放入預(yù)熱到37℃的

0.01MHCl(放入玻片前，0.01MHCl中預(yù)先加入20mg/ml胃蛋白酶160μl)中消化8～10min，經(jīng)過2×SSC溶液再次浸泡5min后，用70%、85%、100%乙醇中梯度脫水，每次3min，自然晾干，56℃烤片2min。第21頁/共50頁標(biāo)本的變性

玻片置73℃變性液(70%甲酰胺)中

5min，然后分別置于－20℃的70%、85%、

100%冰乙醇中各脫水各3min，自然晾干，

45～50℃烤片。第22頁/共50頁探針變性

按照比例(雜交緩沖液:探針:水=7∶2∶

1)混合，離心1～3s，73℃變性5min，45～

50℃放置5～10min。(允許FISH探針和目標(biāo)DNA同時(shí)聯(lián)合變性)第23頁/共50頁雜交

將10μl探針置于雜交區(qū)內(nèi)，覆蓋蓋玻片，封片膠封邊，置保濕盒恒溫42℃雜交

10～16h。第24頁/共50頁洗脫

拆片，在46℃水浴中，50%甲酰胺/2×SSC液洗滌3次，每次7min;2×SSC液洗滌10min;0.1%np－40/2×SSC洗滌5min。室溫70%乙醇洗滌3min，暗處自然晾干。第25頁/共50頁DAPI染色和熒光鏡檢DAPI染色和熒光鏡檢:每片加DAPI10μl，蓋上蓋玻片，染色15～20min，結(jié)果用熒光顯微鏡觀察，選擇背景干凈、雜交信號(hào)清晰形態(tài)圓形或近于圓形的細(xì)胞記數(shù)，并照像。第26頁/共50頁臨床實(shí)驗(yàn)中FISH結(jié)果判別

每張羊水玻片至少計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，判斷標(biāo)準(zhǔn)為:若正常細(xì)胞數(shù)≥90%則判為正常，若異常細(xì)胞數(shù)≥60%則判為異常，若異常細(xì)胞數(shù)大于15%并且小于60%，則需要重新檢測(cè)并加倍計(jì)數(shù)到100以上。第27頁/共50頁FISH檢測(cè)結(jié)果

采用雙色13/21號(hào)染色體熒光探針檢測(cè)

13號(hào)、21號(hào)染色體正常胎兒可見2個(gè)綠色熒光信號(hào)和2個(gè)紅色熒光信號(hào)。第28頁/共50頁FISH檢測(cè)結(jié)果

13號(hào)染色體正常可見2個(gè)綠色熒光信號(hào)，21號(hào)染色體三體胎兒可見3個(gè)紅色熒光信號(hào)。第29頁/共50頁FISH用于產(chǎn)前診斷主要探針

染色體數(shù)目異常是臨床上最主要的染色體病，其中13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X、Y染色體數(shù)目異常最為常見，由于13，18，21，X和Y這5種染色體的非整倍體異常約占所有染色體異常的65％～80％，占染色體異常導(dǎo)致出生缺陷的85％～95％，因此FISH用于快速產(chǎn)前診斷主要是針對(duì)這5種染色體設(shè)計(jì)使用熒光標(biāo)記的探針。第30頁/共50頁FISH用于產(chǎn)前診斷的指征a.妊娠婦女血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)高危者（大于等于1/270)及臨界風(fēng)險(xiǎn)者(小于1/270至大于等于1/1000）。b.妊娠婦女到預(yù)產(chǎn)期時(shí)高齡年齡≥35歲。c.雙親之一為易位攜帶者。d.不良孕產(chǎn)史。e.超聲檢查胎兒異常者。第31頁/共50頁FISH敏感度和特異度均較高

FISH用于產(chǎn)前診斷檢測(cè)的敏感度和特異度均較高。例1.有報(bào)道FISH檢測(cè)4500例未培養(yǎng)羊水細(xì)胞，對(duì)于常染色體的敏感度為92.6%，特異度為100％；性染色體敏感度為100％，特異度為99.9%。例2.Tepperberg等總結(jié)美國25個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用FISH檢測(cè)5348例羊水資料，結(jié)果敏感度為99.6%，特異度為99.98%，陽性預(yù)測(cè)值為99.8%，陰性預(yù)測(cè)值為99.96%。例3.Caine等回顧性分析24742例FISH檢測(cè)羊水間期細(xì)胞的敏感度為99.54%，特異度為99.97%，陽性預(yù)測(cè)值為99.54%，陰性預(yù)測(cè)值為99.97%；由此可見，F(xiàn)ISH用于快速產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性較高。第32頁/共50頁FISH產(chǎn)前診斷技術(shù)臨床應(yīng)用

染色體數(shù)目異常是引起新生兒先天性遺傳病的主要因素之一。傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)、染色體核型分析是宮內(nèi)產(chǎn)前診斷胎兒染色體疾病的主要方法,但該方法所需時(shí)間長、技術(shù)難度大、易受培養(yǎng)條件的影響。對(duì)未經(jīng)培養(yǎng)的羊水間期細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè),快速診斷胎兒常見的三體型及性染色體數(shù)目異常,具有快速、簡便、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。第33頁/共50頁FISH產(chǎn)前診斷技術(shù)臨床應(yīng)用價(jià)值

正常情況下羊水失敗率約為0.5%，超過妊娠24周后培養(yǎng)失敗率升至10%。FISH檢測(cè)的成功率2002年后陸續(xù)有大樣本研究報(bào)道了較為一致的成功率，約為95%～98％。后隨著商品化探針的上市，操作程序規(guī)范化后失敗率大大降低。傳統(tǒng)核型分析最少需要15mL羊水標(biāo)本，而FISH只需3～5mL羊水。第34頁/共50頁FISH產(chǎn)前診斷技術(shù)在國外應(yīng)用

FISH技術(shù)最先在美國用于產(chǎn)前診斷，而到2000年鑒于FISH技術(shù)具有高度的敏感性和特異性，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（ACMG）宣布FISH技術(shù)可以用于常見染色體數(shù)目異常的確診。此后，F(xiàn)ISH技術(shù)在一些發(fā)達(dá)國家被廣泛用于快速產(chǎn)前診斷。檢測(cè)結(jié)果一般可以在24～48h就可以獲得，且檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果的一致性可以達(dá)到99.5％以上。第35頁/共50頁產(chǎn)前診斷技術(shù)臨床應(yīng)用價(jià)值

在過去30年中視核型分析為產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。FISH技術(shù)與核型分析相比，可快速得到結(jié)果，該優(yōu)勢(shì)能彌補(bǔ)其在診斷準(zhǔn)確性方面的欠缺，特別是隨著FISH探針的商品化及實(shí)驗(yàn)方法日臻完善，F(xiàn)ISH的可靠性逐步證實(shí)，間期細(xì)胞核FISH技術(shù)可以提供可靠的產(chǎn)前診斷結(jié)果，結(jié)果直觀且便于解釋，滿足了臨床的需要，有利于臨床決策和減輕孕婦過于焦慮的情緒。第36頁/共50頁FISH與母源細(xì)胞污染

羊膜腔穿刺時(shí)母源細(xì)胞污染可影響標(biāo)本質(zhì)量，導(dǎo)致誤診發(fā)生。建議發(fā)生嚴(yán)重母血污染時(shí)不要進(jìn)行FISH檢測(cè)。影響FISH結(jié)果的母體細(xì)胞來源羊膜腔穿刺中母體的淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不會(huì)生長。出現(xiàn)母體細(xì)胞污染的原因很大程度上與臨床標(biāo)本采集時(shí)操作有關(guān)。因此臨床羊膜腔穿過程中應(yīng)盡量避開胎盤穿刺，對(duì)最初抽出的2～4mL羊水改行其他檢測(cè)。第37頁/共50頁稽留流產(chǎn)與染色體異常

孕早期胚胎染色體異常是稽留流產(chǎn)最重要的原因的原因之一，自然流產(chǎn)中胚胎染色體異常占50%左右，而胚胎染色體數(shù)目異常，包括整倍體和非整倍體，為其發(fā)生的重要因素。第38頁/共50頁FISH應(yīng)用于流產(chǎn)胚胎絨毛

絨毛染色體檢查是診斷胎兒染色體異常的可靠依據(jù)。由于絨毛染色體制備成功率易受其取材時(shí)間及標(biāo)本質(zhì)量的影響，常造成標(biāo)本分裂相少或染色體形態(tài)不佳等狀況，給診斷帶來困難。而FISH分析無需作細(xì)胞培養(yǎng)及顯帶分析，僅作細(xì)胞計(jì)數(shù)，其優(yōu)勢(shì)是不僅適用于分裂中期的染色體，也適用于間期核及細(xì)胞周期的所有階段。第39頁/共50頁FISH應(yīng)用于流產(chǎn)胚胎絨毛

選用13、16、18、21、22、X和Y染色體上的探針對(duì)未培養(yǎng)的絨毛組織進(jìn)行熒光原位雜交來診斷染色體異常，雜交信號(hào)明亮,敏感度高,特異性強(qiáng)，克服了流產(chǎn)絨毛組織易污染導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)不成功，核型分析困難等導(dǎo)致結(jié)果難出的尷尬局面。第40頁/共50頁FISH應(yīng)用于流產(chǎn)胚胎絨毛

胎兒自身的遺傳學(xué)異常才是導(dǎo)致早期流產(chǎn)的主要原因，絨毛染色體FISH分析可對(duì)自然流產(chǎn)的原因及時(shí)作出遺傳學(xué)方面的判斷，尤其是對(duì)高危因素的流產(chǎn)絨毛常規(guī)行染色體FISH檢測(cè)是有必要的。對(duì)習(xí)慣性自然流產(chǎn)的高危因素及其臨床絨毛染色體的分析研究，不僅能夠?yàn)榛袅鳟a(chǎn)的病因?qū)W研究提供理論依據(jù)，而且對(duì)患者再次妊娠的治療也具有指導(dǎo)作用，因此開展流產(chǎn)胚胎絨毛組織的FISH染色體檢查是相當(dāng)有意義的。第41頁/共50頁流產(chǎn)胚胎絨毛FISH圖16號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（綠色）22號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（紅色）第42頁/共50頁流產(chǎn)胚胎絨毛FISH圖13號(hào)染色體探針信號(hào)三個(gè)（綠色）