第十三章遺傳修飾動(dòng)物模型4/25/20231遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第1頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念及其發(fā)展簡(jiǎn)史轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)：是指基因組中整合有外源基因、外源基因能夠表示并按孟德爾定律遺傳一類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因(transgene)：將外源基因整合入動(dòng)物基因組中操作。嵌合體動(dòng)物(chimera)：部分組織中整合有外源基因動(dòng)物。4/25/20232遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第2頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念及其發(fā)展簡(jiǎn)史轉(zhuǎn)基因三個(gè)層次：細(xì)菌轉(zhuǎn)基因離體真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因4/25/20233遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第3頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念及其發(fā)展簡(jiǎn)史

人類疾病動(dòng)物模型(Animalmodelsofhumandiseases)是指在醫(yī)學(xué)研究中，在動(dòng)物身上建立，或形成類似人類疾病動(dòng)物。經(jīng)過動(dòng)物模型直接，或間接反應(yīng)疾病發(fā)生和發(fā)展過程，在了解疾病基礎(chǔ)上開創(chuàng)和改進(jìn)、優(yōu)化疾病治療。

4/25/20234遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第4頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念及其發(fā)展簡(jiǎn)史轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在基因工程和胚胎工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來1961年，Tarkowski等將小鼠卵裂期不一樣品系胚胎細(xì)胞融合后，形成了嵌合體小鼠；1974年，Jaenisch和Mintz將SV40DNA注射入小鼠囊胚中，在小鼠體細(xì)胞檢測(cè)到病毒DNA序列；1980年，Gordon首次將重組DNA注射到小鼠體細(xì)胞中；4/25/20235遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第5頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念及其發(fā)展簡(jiǎn)史1982年，Palmiter將金屬巰基(MTI)基因開啟子控制大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入侏儒小鼠受精卵，得到7只轉(zhuǎn)基因鼠中，有6只生長顯著加緊，體重遠(yuǎn)大于正常對(duì)照，被稱為“超級(jí)小鼠”(Supermice)。82年以后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了大力推廣和研究，至今已制備出小鼠、大鼠、雞、兔、豬、羊、魚等轉(zhuǎn)基因品系。4/25/20236遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第6頁1、第一例嵌合體小鼠1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中得到部分組織中含有SV40DNA嵌合體小鼠。但無任何表型改變。2、第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系1976年建立了世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系，這些小鼠基因組中插人了莫氏白血病病毒基因。他們是利用反轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)把外源DNA插入到小鼠基因組中。3、第一例顯微注射法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠1980年，Gordn等把SV40DNA顯微注射到小鼠受精卵原核中，取得了兩只轉(zhuǎn)基因小鼠，創(chuàng)建了顯微注射轉(zhuǎn)基因方法。4/25/20237遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第7頁4、“超級(jí)鼠”1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫?，取得了成年體重是對(duì)照組小鼠2倍“超級(jí)鼠”，首先證實(shí)外源基因可在受體中表示，而且表示產(chǎn)物含有生物活性。5、轉(zhuǎn)基因家畜產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家兔、綿羊和豬(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相繼出世。4/25/20238遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第8頁4/25/20239遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第9頁4/25/202310遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第10頁6、利用轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)重組蛋白1987年，Simons等在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中得到綿羊β-球蛋白，1988年，該研究小組又從轉(zhuǎn)基因綿羊乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。當(dāng)前，已經(jīng)有數(shù)十種蛋白實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)。7、轉(zhuǎn)YAC轉(zhuǎn)基因小鼠近10年內(nèi)，陸續(xù)出現(xiàn)用全長酵母人工染色體（YAC）DNA來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。4/25/202311遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第11頁東北農(nóng)業(yè)大學(xué)－國內(nèi)首例綠色熒光蛋白“轉(zhuǎn)基因”克隆豬綠色熒光蛋白－豬胎兒成纖維細(xì)胞－克隆4/25/202312遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第12頁1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名羅斯林研究所誕生。轉(zhuǎn)基因母羊乳汁中能夠分泌α-抗胰蛋白酶。4/25/202313遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第13頁年，F(xiàn)DA同意轉(zhuǎn)基因鮭魚4/25/202314遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第14頁轉(zhuǎn)基因動(dòng)物意義：基因整體功效說明只有在活體內(nèi)經(jīng)過整體動(dòng)物研究才能到達(dá)；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)、毒理學(xué)、安全性評(píng)價(jià)主要工具。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用途：（l）疾病型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；（2）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥；（3）動(dòng)物改良型；（4）基礎(chǔ)生物學(xué)研究第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念及其發(fā)展簡(jiǎn)史4/25/202315遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第15頁（l）疾病型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物替換：防止了人體試驗(yàn)造成風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題。潛伏期長，病程長和發(fā)病率低疾病可控：品系，感染病原體試驗(yàn)環(huán)境方便：樣品搜集結(jié)果分析輕易（統(tǒng)計(jì)）；人畜共患病比較，研究疾病機(jī)理4/25/202316遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第16頁（2）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥：生物反應(yīng)器重組蛋白藥品歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)年6月2日首次同意了用轉(zhuǎn)基因山羊奶研制而成抗血栓藥品Atryn（抗凝血酶）上市

當(dāng)前世界上還有利用轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人α-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺氣腫藥品）、重組組織血纖維蛋白溶酶原激活劑（抗栓藥）和人C1抑制劑（治療血管神經(jīng)性水腫藥品）等重組蛋白藥品也已經(jīng)完成或進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)，尤其是治療性抗體藥品，發(fā)展?jié)摿Ω蟆?/25/202317遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第17頁當(dāng)前已在以下動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥品：牛：抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、乳鐵蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等；山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、組織纖溶原激活因子、單克隆抗體等；綿羊：抗胰蛋白酶、凝血因子Ⅸ、蛋白C；豬：凝血因子Ⅸ、蛋白C、纖維蛋白原、血紅蛋白。4/25/202318遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第18頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟1.轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建2.將外源基因引入受體胚胎3.經(jīng)過胚胎移植和基因型判定取得攜帶外源基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物4.經(jīng)過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表型分析研究外源基因功效4/25/202319遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第19頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟基本原理將改建后目標(biāo)基因用顯微注射等方法注入試驗(yàn)動(dòng)物受精卵，然后將此受精卵再植入受體動(dòng)物輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，人們能夠經(jīng)過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良品種工程動(dòng)物等。4/25/202320遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第20頁目標(biāo)基因分離與克隆表示載體構(gòu)建卵母細(xì)胞搜集體外成熟培養(yǎng)基因?qū)朕D(zhuǎn)基因胚胎取得取得子代動(dòng)物轉(zhuǎn)基因胚胎移植轉(zhuǎn)基因整合表示檢測(cè)取得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受體動(dòng)物選擇4/25/202321遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第21頁構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體含有外源目標(biāo)基因重組載體導(dǎo)入受體胚胎轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育及判定經(jīng)過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表型分析研究外源基因功效4/25/202322遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第22頁

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線經(jīng)典技術(shù)路線

目標(biāo)基因

顯微注射

已交配受體動(dòng)物

供體動(dòng)物輸卵管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取出

移植妊娠

缺點(diǎn)：注入目標(biāo)基因命中率低，目標(biāo)基因整合率低，受精卵移植受孕率低。受精卵4/25/202323遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第23頁轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線(續(xù))

整合胚胎移植技術(shù)路線

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受體動(dòng)物子宮

目標(biāo)基因

非手術(shù)

胚胎移植

體外受精

體外培養(yǎng)

檢測(cè)

卵子受精卵多細(xì)胞胚胎整合外源基因

精子或囊胚胚胎優(yōu)點(diǎn)：

受精卵成活率高達(dá)90％以上，外源基因整合率高，提升受孕率。4/25/202324遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第24頁

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線（續(xù)）整合卵受精技術(shù)路線：

目標(biāo)基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

導(dǎo)入

逆轉(zhuǎn)錄病毒妊娠

精子

感染

體外受精

胚胎移植

卵母細(xì)胞成熟卵細(xì)胞囊胚受體動(dòng)物子宮

特點(diǎn)：卵母細(xì)胞導(dǎo)入目標(biāo)基因后再與精子受精。4/25/202325遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第25頁

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線（續(xù)）核移植（克隆）技術(shù)路線

目標(biāo)基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

導(dǎo)入

動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞妊娠

取核

動(dòng)物

重組

囊胚期

受體動(dòng)物

卵細(xì)胞受精卵胚胎子宮

去核體外培養(yǎng)胚胎移植特點(diǎn)：體細(xì)胞核移植；核移植前導(dǎo)入目標(biāo)基因。4/25/202326遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第26頁表示調(diào)控元件＋目標(biāo)基因＋匯報(bào)基因假如觀察外源基因表示所引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)，可選擇表示水平高而無組織特異性強(qiáng)開啟子，如CMV、pGK等；假如希望觀察外源基因在特定組織器官中功效，應(yīng)選取組織特異性開啟子，如肝蛋白開啟子、胰島素開啟子等；可誘導(dǎo)型開啟子調(diào)控外源基因表示。4/25/202327遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第27頁1.外源目標(biāo)基因分離2.外源目標(biāo)基因與轉(zhuǎn)性基因表示開啟子、增強(qiáng)子、匯報(bào)基因等構(gòu)件拼接重組3.重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞4.胚胎移植技術(shù)5.判定及篩選6.目標(biāo)基因整合率及表示效率檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物關(guān)鍵技術(shù)包含4/25/202328遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第28頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及制備轉(zhuǎn)基因載體要求：開啟子目標(biāo)基因匯報(bào)基因多聚腺苷酸化信號(hào)絕緣子4/25/202329遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第29頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟開啟子：①組成型開啟子②組織特異型開啟子③誘導(dǎo)型開啟子④誘導(dǎo)型組織特異型開啟子4/25/202330遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第30頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟Kozak序列（ACCAUGG）：核糖體能夠識(shí)別mRNA上這段序列，并把它作為翻譯起始位點(diǎn)。注意這段序列并不是ribosomalbindingsite(RBS)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，而是帽子結(jié)構(gòu)。

真核生物基因中起始密碼子上下游最正確序列為，-3位為嘌呤堿基；+4位為G，起始密碼子AUG中A處于+1位。A/GCCAUGG被稱為kozak序列或掃描序列。

4/25/202331遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第31頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟KOZAK是一個(gè)女科學(xué)家，她研究過起始密碼子AUG周圍堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：——G/N-C/N-C/N-ANNAUGG——，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，尤其是-3位A對(duì)翻譯效率非常主要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表示載體構(gòu)建中。

4/25/202332遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第32頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟Kozak規(guī)則，即第一個(gè)AUG側(cè)翼序列堿基分布所滿足統(tǒng)計(jì)規(guī)律，若將第一個(gè)AUG中堿基A，U，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述以下：

(1)第4位偏好堿基為G；(2)AUG5’端約15bp范圍側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。

4/25/202333遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第33頁4/25/202334遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第34頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟絕緣子：在基因組內(nèi)建立獨(dú)立轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域邊界DNA序列稱為絕緣子/隔離子（insulator）。絕緣子能夠阻止鄰近增強(qiáng)子或緘默子對(duì)其界定基因開啟子發(fā)揮調(diào)控作用。

4/25/202335遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第35頁絕緣子元件阻斷鄰近增強(qiáng)子活性

4/25/202336遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第36頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟目標(biāo)基因以往構(gòu)件目標(biāo)基因時(shí)普通使用基因文庫中cDNA序列，實(shí)踐證實(shí)僅有cDNA序列往往難以得到有效表示，最少一個(gè)內(nèi)含子與cDNA序列結(jié)合會(huì)使基因得到更加好表示，常使用基因組DNA。4/25/202337遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第37頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟匯報(bào)基因是一個(gè)編碼可被檢測(cè)蛋白質(zhì)或酶基因，也就是說，是一個(gè)其表示產(chǎn)物非常輕易被判定基因。慣用LacZ、EGFP等便于觀察多聚腺苷酸化信號(hào)4/25/202338遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第38頁4/25/202339遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第39頁4/25/202340遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第40頁4/25/202341遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第41頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟轉(zhuǎn)基因方法:1、受精卵雄原核顯微注射法（最慣用）2、胚胎干細(xì)胞（ES）法3、逆轉(zhuǎn)錄病毒法4、體細(xì)胞核移植法5、精子載體法6、YAC法4/25/202342遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第42頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟轉(zhuǎn)基因慣用細(xì)胞：1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動(dòng)物子宮→胚胎→個(gè)體。2）胚胎干細(xì)胞：從著床前動(dòng)物胚胎中分離多功效胚胎干細(xì)胞→基因操作→注射入動(dòng)物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個(gè)體。4/25/202343遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第43頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟受精卵雄原核顯微注射法：

以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好載體DNA直接注射入受精卵雄原核，再將接收注射受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育取得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。4/25/202344遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第44頁4/25/202345遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第45頁4/25/202346遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第46頁4/25/202347遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第47頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟載體DNA制備胚胎操作過程

ａ受精卵準(zhǔn)備ｂ顯微注射ｃ假孕母鼠準(zhǔn)備(養(yǎng)母)ｄ胚胎移植對(duì)幼鼠判定4/25/202348遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第48頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟目標(biāo)基因能夠起源于：①經(jīng)過限制性內(nèi)切酶預(yù)先分離某一基因。②逆轉(zhuǎn)錄法得到cDNA。③人工合成DNA片段。④聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段。4/25/202349遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第49頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟目標(biāo)基因克隆能夠經(jīng)過載體方式進(jìn)行，通常選擇質(zhì)粒作為載體。將目標(biāo)基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組因子，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，擴(kuò)增質(zhì)粒，再分離純化重組質(zhì)粒DNA，用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化，制備成線狀基因片段備用。4/25/202350遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第50頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟胚胎操作過程卵供體母鼠和假孕母鼠準(zhǔn)備定時(shí)準(zhǔn)備相當(dāng)數(shù)量卵供體母鼠和假孕母鼠以及一批相對(duì)穩(wěn)定正常公鼠與結(jié)扎公鼠。這些鼠相關(guān)要求以下表4/25/202351遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第51頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟超排卵與取卵

選擇4~6周齡母鼠，注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）后，隔42~48h再注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后10~13h剖腹取卵，用培養(yǎng)液保留，置CO2培養(yǎng)箱備用。4/25/202352遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第52頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟基因顯微注射

用專門持卵管和注射針，在顯微注射儀上操作，將純化目標(biāo)基因（DNA）注射到受精卵雄性原核內(nèi)。4/25/202353遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第53頁operationpanel

holdingpipette

microneedle.

eyelens4/25/202354遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第54頁顯微注射法

顯微注射法是在顯微注射儀上，一側(cè)用吸管固定受精卵，另一側(cè)將注射針插入受精卵原核（普通是雄原核）。拔出顯微注射針解除固定管負(fù)壓，操作完成。

4/25/202355遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第55頁4/25/202356遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第56頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟受精卵移植

轉(zhuǎn)基因受精卵在單細(xì)胞至桑椹胚階段移植到受孕后0.5d假孕母鼠輸卵管，在囊胚期則移植到受孕后2.5d假孕母鼠子宮。每只假孕母鼠移植20~30個(gè)轉(zhuǎn)基因卵為宜。4/25/202357遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第57頁X1-cellpronuclearstagemouseembryo.PMS+HCGtosuperovulatePregnantFosterMotherOviductTransfer++2-cellstageembryoHoldingPipetteInjectionPipette4/25/202358遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第58頁EventsDuringTransgenesisDAYFertilization12

AM12

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AM12

AM12

AM12

AM12

AMReimplantationMatingMicroinjectionCell

DivisionGestationBirthEmbryoRecoveryE1E2E2112345hCGPMS4/25/202359遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第59頁1.結(jié)扎公鼠制備為了取得同時(shí)發(fā)情假孕母鼠，要準(zhǔn)備結(jié)扎公鼠，通常選取5周齡公鼠做手術(shù)，分籠喂養(yǎng)，每籠一只。術(shù)后2～3周即完全康復(fù)，可用其生產(chǎn)假孕母鼠。目標(biāo)：為了產(chǎn)生同期發(fā)情母鼠第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202360遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第60頁4/25/202361遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第61頁2.超數(shù)排卵供體母鼠（不動(dòng)情25g母鼠）腹腔注射PMSG10U（馬血清促性腺激素），普通選擇在中午注射，間隔48小時(shí)后注射HCG（人絨毛膜促性腺激素），光照周期保持12～14h；第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202362遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第62頁4/25/202363遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第63頁3.同期發(fā)情將注射HCG后母鼠與正常公鼠合籠，并于第二天早上檢驗(yàn)陰道栓，假如見栓說明已經(jīng)配上種了，計(jì)做懷孕0天。受體母鼠(普通發(fā)情母鼠)與結(jié)扎公鼠合籠，第二天早上檢驗(yàn)陰道栓，有栓母鼠可用于胚胎移植（假孕母鼠）。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202364遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第64頁4/25/202365遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第65頁計(jì)算時(shí)間與結(jié)扎公鼠4/25/202366遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第66頁4.胚胎搜集和預(yù)處理（1）受精卵搜集和處理見栓當(dāng)日胚胎處于1細(xì)胞期。以脫頸椎法殺死母鼠，暴露子宮、輸卵管；剪下子宮、輸卵管，并置于平皿中；在滅菌平皿中剪下輸卵管置入盛有沖卵液集卵杯中，在體視顯微鏡下撕開壺腹部，釋放受精卵并用新鮮培養(yǎng)液洗1–2次。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202367遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第67頁4/25/202368遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第68頁4/25/202369遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第69頁用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán)4/25/202370遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第70頁4/25/202371遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第71頁（2）2～8細(xì)胞胚胎搜集交配后20–60小時(shí)，輸卵管中存在有2–8細(xì)胞期胚胎。此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)脫掉，可用1ml注射器自輸卵管傘口沖得胚胎。其基本步驟以下：取輸卵管，在體視顯微鏡下找到輸卵管傘口，傘口呈平截狀，周圍略顯粗糙。然后，用鑷子輕輕夾住傘口下部位，慢慢將沖卵針插入傘口，再用鑷子輕輕夾住針頭，推壓注射器，胚胎從另一端沖出。洗滌胚胎：搜集沖得胚胎，用新鮮培養(yǎng)液洗1–2次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)過程。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟沖卵4/25/202372遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第72頁

5.胚胎移植（1）輸卵管移植依據(jù)胚胎數(shù)，確定供胚胎移植受體母鼠數(shù)，并做好手術(shù)準(zhǔn)備。手術(shù)切口位于兩側(cè)腰部距背正中線1cm處，左右各一個(gè)相互平行切口。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202373遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第73頁4/25/202374遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第74頁小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手術(shù)剪切開小鼠皮膚、肌肉、打開腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪墊，并用鑷子夾住脂肪組織，把卵巢、輸卵管和一部分子宮角慢慢拉出，經(jīng)過用紗布保護(hù)切口置于紗布上。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202375遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第75頁4/25/202376遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第76頁4/25/202377遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第77頁在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸收胚胎，次序?yàn)槭炗?、空氣?、培養(yǎng)液、空氣泡2、胚胎(盡可能少帶入培養(yǎng)液)。空氣泡3、培養(yǎng)液。4/25/202378遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第78頁4/25/202379遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第79頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟用顯微注射方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，操作技術(shù)性很強(qiáng)，即使是受過嚴(yán)格訓(xùn)練專業(yè)人員操作，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受精卵也只占注射卵5％。所以人們往往來用增大微注射受精卵數(shù)目標(biāo)方法來填補(bǔ)這一缺點(diǎn)。4/25/202380遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第80頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟優(yōu)點(diǎn)：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高；不依賴載體缺點(diǎn)：儀器珍貴，技術(shù)要求高，效率低，隨機(jī)整合，卵細(xì)胞傷害大，胚胎易損傷4/25/202381遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第81頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟胚胎干細(xì)胞（ES）法：（ES細(xì)胞，Embryostemcell）是指囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中還未進(jìn)行分化細(xì)胞，這種細(xì)胞含有類似癌細(xì)胞無限繁殖和高度分化潛能。將攜帶有外源基因ES細(xì)胞注入到動(dòng)物早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。4/25/202382遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第82頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟胚胎干細(xì)胞特點(diǎn)：它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，含有高度全能性，能夠形成包含生殖細(xì)胞在內(nèi)全部組織，而且在不一樣培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不一樣功效狀態(tài)。4/25/202383遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第83頁4/25/202384遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第84頁4/25/202385遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第85頁4/25/202386遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第86頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟步驟：1、分離ES細(xì)胞2、將包含目標(biāo)基因載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入ES細(xì)胞3、體外培養(yǎng)篩選陽性克隆4、陽性克隆轉(zhuǎn)入受體囊胚并移植入假孕養(yǎng)母子宮5、子代嵌合體判定，雜交生成純合子4/25/202387遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第87頁EScellCultureTargetedESCellsPurePopulationofTargetedESCellsTargetedESCellsInjectedintoBlastocystPregnantFosterMotherXChimeraBlastocystderivedfrommousewithwhitecoat.BreedtoWTwhitemouseGermlinetransmissionofEScell-derivedgenome.UterineTransfer4/25/202388遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第88頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟利用胚胎干細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要策略及方法1.胚胎嵌正當(dāng)2.細(xì)胞核移植法：移植到卵母細(xì)胞核中3.體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞和精子4.利用成體干細(xì)胞中精原干細(xì)胞生成”轉(zhuǎn)基因精子“：遷移入精巢原始生殖細(xì)胞，是一個(gè)干細(xì)胞，經(jīng)過減數(shù)分裂可形成精子。4/25/202389遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第89頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟步驟：1、分離ES細(xì)胞2、將包含目標(biāo)基因載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入ES細(xì)胞3、體外培養(yǎng)篩選陽性克隆4、陽性克隆轉(zhuǎn)入受體囊胚并移植入假孕養(yǎng)母子宮5、子代嵌合體判定，雜交生成純合子4/25/202390遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第90頁4/25/202391遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第91頁囊胚固定細(xì)胞注入內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

4/25/202392遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第92頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)、定位、表示水平及插入穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細(xì)胞方法多樣，細(xì)胞判定及篩選方便4/25/202393遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第93頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體4/25/202394遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第94頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟生殖細(xì)胞載體法

有體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染生殖細(xì)胞兩種方法，前者又包含精子載體法、卵子載體法、受精卵載體法、胞漿內(nèi)精子注射法等。

精子載體法是將成熟精子與外源DNA載體共同孵育，使精子攜帶外源DNA，受精后外源DNA整合至染色體中。

此法理論上是可行、也有成功先例，但成功率不高、效果不穩(wěn)定，有待繼續(xù)探索、完善。4/25/202395遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第95頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟逆轉(zhuǎn)錄和慢病毒轉(zhuǎn)染法將目標(biāo)基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒（或慢病毒）載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以到達(dá)感染目標(biāo)),取得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法。4/25/202396遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第96頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟慢病毒（Lentiviruses）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物含有噬核特征，病毒基因組運(yùn)輸至細(xì)胞核，從而使慢病毒能夠感染和在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制。這一特征使慢病毒成為基因治療轉(zhuǎn)移載體。4/25/202397遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第97頁慢病毒載體是指以人類免疫缺點(diǎn)病毒-1(HIV-1)起源一個(gè)病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)主要組成部分。攜帶有外源基因慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力病毒顆粒，經(jīng)過感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表示。

第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/202398遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第98頁4/25/202399遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第99頁4/25/2023100遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第100頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟HIV（Humanimmunodeficiencyvirus）EIAV（Equineinfectiousanemiavirus）FIV（Felineimmunodeficiencyvirus）SIV（Simianimmunodeficiencyvirus）其中研究最多最為透徹是HIV。

4/25/2023101遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第101頁4/25/2023102遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第102頁4/25/2023103遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第103頁4/25/2023104遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第104頁gag,-----群抗原基因，編碼關(guān)鍵蛋白p24pol-----多聚酶基因，編碼多聚酶；env-----包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41；tat-----基因反式激活因子對(duì)HIV-1基因其正調(diào)控作用rev,-----病毒蛋白表示調(diào)整因子，能增加gag和env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白表示vif,-----病毒感染因子,其作用是在一些細(xì)胞因子協(xié)下促進(jìn)HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)Vpr,-----R蛋白能使HIV在巨噬細(xì)胞中增殖vpu,-----U蛋白，能促進(jìn)HIV從細(xì)胞膜上釋放nef,----負(fù)因子，含有抑制HIV-1增殖作用4/25/2023105遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第105頁慢病毒載體發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)階段第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表。在構(gòu)建時(shí)把HIV-1基因組中進(jìn)行包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需順式作用元件與編碼反式作用蛋白序列分離，分別構(gòu)建在三個(gè)獨(dú)立質(zhì)粒表示系統(tǒng)上，即包裝質(zhì)粒（一個(gè)強(qiáng)開啟子如CMV作用下，控制除env以外全部病毒結(jié)構(gòu)基因表示）、包膜質(zhì)粒（包含VSV-G基因）和載體質(zhì)粒（包含目標(biāo)基因），僅去除包膜蛋白4/25/2023106遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第106頁慢病毒載體發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)階段第二代慢病毒載體系統(tǒng)從安全性角度又刪去了HIV全部從屬基因，僅包含gag、pol、tat、rev基因。第三代慢病毒載體又深入做了些安全方面改進(jìn)，如刪除了U3區(qū)3′LTR和tat基因，將rev基因分離稱為四質(zhì)粒系統(tǒng)4/25/2023107遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第107頁病毒載體系統(tǒng)中，病毒感染目標(biāo)細(xì)胞后不會(huì)再感染其它細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新病毒顆粒，也就是假型病毒。pHelper負(fù)責(zé)編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，特異性酶，基因表示調(diào)整因子，提供病毒包裝所需要包膜蛋白等。通常分為兩質(zhì)粒和三質(zhì)粒系統(tǒng)兩種。

第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/2023108遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第108頁ψ包裝質(zhì)粒包膜質(zhì)粒4/25/2023109遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第109頁4/25/2023110遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第110頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟優(yōu)點(diǎn)：受精卵攜帶外源基因陽性率高；外源基因多單拷貝整合；操作簡(jiǎn)單，防止注射法對(duì)卵子損害；宿主范圍廣；可同時(shí)感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高4/25/2023111遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第111頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟缺點(diǎn)：容納大小有限（≤10kb）；潛在致癌性,載體復(fù)雜；整合率不高,胚胎自我保護(hù)機(jī)制對(duì)其有抗性4/25/2023112遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第112頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟存在問題：1、重組病毒滴度還不夠高，均在101TU/ml～103TU/ml之間，難以到達(dá)體內(nèi)應(yīng)用需要；2、建立穩(wěn)定HIV載體包裝細(xì)胞十分困難，已建立包裝細(xì)胞均不理想。據(jù)報(bào)道，Vpr是一個(gè)使細(xì)胞進(jìn)入靜止期強(qiáng)誘導(dǎo)劑，也是建立包裝細(xì)胞主要障礙之一。4/25/2023113遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第113頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟步驟：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建2.選擇和培養(yǎng)包裝細(xì)胞系3.重組病毒DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞4.搜集重組病毒顆粒5.感染胚胎細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化4/25/2023114遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第114頁4/25/2023115遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第115頁4/25/2023116遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第116頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟體細(xì)胞核移植法（轉(zhuǎn)基因＋克?。⑼庠椿?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞細(xì)胞核進(jìn)行核移植（把體細(xì)胞核植入一個(gè)去了核卵母細(xì)胞中，融合并激活），將重組胚進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同時(shí)化假孕動(dòng)物輸卵管。4/25/2023117遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第117頁4/25/2023118遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第118頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟優(yōu)點(diǎn)：對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后，用于核移植能夠提升轉(zhuǎn)基因效率，不但含有“ES細(xì)胞路徑”全部優(yōu)點(diǎn)，且物種適用面廣。無需經(jīng)過嵌合體育種就可取得純合個(gè)體，周期短，效率高。4/25/2023119遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第119頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟缺點(diǎn)：技術(shù)上難度大，成功率極低，胚胎死亡率高，非普通試驗(yàn)室能夠開展。4/25/2023120遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第120頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟精子載體法直接以精子為載體轉(zhuǎn)基因方法：將成熟精子與外源DNA共培養(yǎng)，成熟精子與外源DNA預(yù)培養(yǎng)之后，使精子有能力攜帶外源DNA進(jìn)入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色體中。4/25/2023121遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第121頁外源DNA導(dǎo)入精細(xì)胞方法有DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。4/25/2023122遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第122頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟受體介導(dǎo)法：是將外源DNA與受體分子連接后與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)，受體能夠介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。4/25/2023123遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第123頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟YAC和BAC介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移酵母人工染色體（YAC）載體是近年來發(fā)展起來新型載體,能克隆百萬對(duì)堿基大片段DNA。優(yōu)點(diǎn)：確保大片段DNA完整性確保較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中整合率高確保了目標(biāo)基因上下游側(cè)翼序列完整性因而能夠消除或減弱基因整合后位置效應(yīng)。4/25/2023124遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第124頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟YAC：基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定功效序列,人們利用這些序列構(gòu)建載體,重組后DNA以線性狀態(tài)存在,這么不但穩(wěn)定,而且大大提升了插入外源基因能力,而且能夠像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工染色體。如利用從酵母染色體上分離ARS、CEN、TEL序列構(gòu)建載體，然后用這種載體構(gòu)建染色體即稱為酵母人工染色體。YAC載體裝載量為350-400kb4/25/2023125遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第125頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟YAC主要功效成份有三：1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。2）端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶侵襲，預(yù)防粘附到其它斷裂端，確保了染色體穩(wěn)定存在。3）自主復(fù)制序列（ARS）元件：是染色體自主復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)。

構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列：2個(gè)端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。4/25/2023126遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第126頁4/25/2023127遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第127頁4/25/2023128遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第128頁4/25/2023129遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第129頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟YAC缺點(diǎn)：1、內(nèi)部存在嵌合及重組等現(xiàn)象，即在一個(gè)YAC克隆里含有兩個(gè)原來不相連獨(dú)立片段；2、一些克隆不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)缺失或重排其中片段；3、另外，因?yàn)閅AC與酵母染色體含有相同結(jié)構(gòu)，所以YAC極難與酵母染色體區(qū)分開，而且在轉(zhuǎn)基因操作時(shí)必須尤其小心,以防染色體機(jī)械切割。4/25/2023130遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第130頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟BAC為環(huán)形質(zhì)粒，其復(fù)制子起源于單拷貝質(zhì)粒F因子，故BAC在宿主菌內(nèi)只有極少數(shù)拷貝數(shù)，可穩(wěn)定遺傳，無缺失，重組和嵌合現(xiàn)象，能容納300kbDNA分子。4/25/2023131遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第131頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟BAC以E.coli為宿主，轉(zhuǎn)化效率較高，常規(guī)方法(堿裂解)即可分離BAC：藍(lán)白斑，抗生素，菌落原位雜交等均可用于目標(biāo)基因篩選；可對(duì)克隆在BACDNA直接測(cè)序4/25/2023132遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第132頁4/25/2023133遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第133頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟轉(zhuǎn)入基因整合、表示及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物判定外源基因?qū)牒蟠嬖诜绞?.整合到染色體內(nèi)隨機(jī)整合（非同源重組）定點(diǎn)整合（同源重組）2.游離在細(xì)胞漿內(nèi)暫態(tài)表示3.在核酸酶作用下降解。4/25/2023134遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第134頁外源基因?qū)牒蟊硎颈硎居绊懺?.外源基因本身結(jié)構(gòu)和性質(zhì)2.附帶原核載體次序3.染色體位置4.甲基化5.外源基因在受體細(xì)胞中表示方式表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/2023135遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第135頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟轉(zhuǎn)基因動(dòng)物判定從小鼠尾尖提取基因組DNA為模版進(jìn)行以下判定1、DNA水平檢測(cè)：①PCR判定：引物設(shè)計(jì)應(yīng)區(qū)分內(nèi)源外源基因；②Southern印跡雜交和FISH(熒光原位雜交)：確定整合位置；2、mRNA檢測(cè):northern-blot、RT-PCR3、蛋白產(chǎn)物檢測(cè)：Westernblot等4、表型檢測(cè)：血液生化，病理、免疫組織化學(xué)5、匯報(bào)基因檢測(cè)4/25/2023136遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第136頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟DNA水平PCR、shouthernblot、Dot-blot。原位雜交：PCR原位和染色體原位Protein水平（表型檢測(cè)）血液生化、病理、ELISA、westernblot、免疫組化

RNA水平northern-blot、原位雜交匯報(bào)基因檢測(cè)4/25/2023137遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第137頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟經(jīng)過篩選得到原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(founder)依然只能算作試驗(yàn)材料。慣用PCR進(jìn)行篩選提取鼠尾DNAPCR檢測(cè)出陽性第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/2023138遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第138頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（founder）只能算作過渡材料有很大一部分founder都屬于嵌合體，由轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因兩種細(xì)胞組成。且轉(zhuǎn)入基因在founder動(dòng)物中都呈半合子狀態(tài)。4/25/2023139遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第139頁用founder動(dòng)物與已知非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配，產(chǎn)生F1代后，再經(jīng)過基因整合和表示檢測(cè)，證實(shí)轉(zhuǎn)入基因能夠遺傳給后代，而且在后代中得到表示，才能宣告取得了真正意義上轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/2023140遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第140頁當(dāng)繁殖到陽性率為50%左右時(shí)，即基本上能夠判斷出外源目標(biāo)基因?yàn)閱我晃稽c(diǎn)整合。經(jīng)擴(kuò)大繁殖，從中選擇外源目標(biāo)基因表示效果好、適應(yīng)性好轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行近親繁殖。然后從子代中選擇理想純合子個(gè)體進(jìn)行全同胞兄妹，建立遺傳基因小鼠近交系。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟4/25/2023141遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第141頁4/25/2023142遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第142頁G0代編號(hào)檢測(cè)（3周齡）PCRSouthern4/25/2023143遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第143頁G0代整合檢測(cè)--：棄去+：保留X野生型G1代--：棄去+：半合子X半合子--：棄去+：純合子G2代表型檢測(cè)founder鼠互交4/25/2023144遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第144頁4/25/2023145遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第145頁heterozygote4/25/2023146遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第146頁4/25/2023147遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第147頁4/25/2023148遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第148頁第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨著一些問題生產(chǎn)效率低基因整合效率不高生產(chǎn)周期長，成本高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物死亡率高常出現(xiàn)不育造成轉(zhuǎn)基因難以傳代無法大規(guī)模生產(chǎn)4/25/2023149遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第149頁第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型概念：基因打靶是利用DNA同源重組原理，在基因組中某一特定部位進(jìn)行定點(diǎn)基因重組，是研究基因功效有效伎倆。包含基因敲除（geneknockout）和基因敲入（geneknockin）。4/25/2023150遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第150頁三種技術(shù)融合firstsecondthird4/25/2023151遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第151頁基因剔除(GeneKnockout)基因敲除是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功效未知或未完全知道基因，從分子水平上設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將該基因從動(dòng)物原基因組中去除，或用其它無功效DNA片斷取代，然后從整體觀察試驗(yàn)動(dòng)物表型，推測(cè)對(duì)應(yīng)基因功效。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023152遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第152頁GeneKnockout采取同源重組方法,用體外合成無效基因或突變基因取代對(duì)應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,即為基因敲除動(dòng)物。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023153遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第153頁同源重組分子過程1、兩段較長同源DNA或同源染色體彼此靠攏，在二條相同極性上斷裂2、產(chǎn)生交叉結(jié)構(gòu)3、在交叉處橫斷內(nèi)切，產(chǎn)生4種含有異源雙鏈重組產(chǎn)物4、同源重組發(fā)生于兩個(gè)較長同源DNA或同源染色體之間，且需要重組蛋白A（RecA）參加第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023154遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第154頁4/25/2023155遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第155頁外源基因

宿主基因組

同源重組后基因組

同源重組模式HollidayStructure

4/25/2023156遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第156頁4/25/2023157遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第157頁IfyouknowsomeoftheDNAsequenceflankingaparticulargene,itispossibletodesignvectorsthatreplacethatgene.4/25/2023158遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第158頁通常意義上基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)同源片段替換靶基因片段，從而到達(dá)基因敲除目標(biāo)。4/25/2023159遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第159頁基因敲入（geneknockin）是利用基因同源重組，將外源有功效基因（基因組原先不存在、或已失活基因），轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)取得表示技術(shù)。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023160遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第160頁為何有轉(zhuǎn)基因技術(shù)還要開展基因打靶技術(shù)？轉(zhuǎn)基因技術(shù)缺點(diǎn)：1)因?yàn)檗D(zhuǎn)基因隨機(jī)插入,相鄰基因組序列可能對(duì)其產(chǎn)生影響.2)整合轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)有很高差異.3)為確保轉(zhuǎn)基因表示,注入DNA帶有全部調(diào)控成份,調(diào)控成份可能遠(yuǎn)離編碼序列或位于復(fù)雜基因內(nèi)含子中,難以操作.4)不能研究含有顯性致死表型轉(zhuǎn)基因.4/25/2023161遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第161頁基因打靶技術(shù)不但能夠克服以上問題，還有以下優(yōu)點(diǎn)：1)能夠經(jīng)過同源重組準(zhǔn)確控制整合位點(diǎn),2)能夠檢測(cè)隨機(jī)整合ES細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因表示.第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023162遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第162頁基因敲除載體策略：插入型和置換型插入型載體設(shè)計(jì)時(shí),選擇基因在同源序列之外或之內(nèi),導(dǎo)入宿主細(xì)胞前,需將打靶載體在同源區(qū)制造一個(gè)線性化缺口,這么會(huì)使同源重組效率提升。插入型載體與靶基因在同源區(qū)發(fā)生一次單交換后,將造成整個(gè)載體插入染色體同源區(qū),從而使同源序列增加一個(gè)拷貝。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023163遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第163頁缺點(diǎn)：1、不能區(qū)分隨機(jī)整合與同源插入2、留下選擇標(biāo)識(shí)及其開啟子、增強(qiáng)子可能會(huì)影響鄰近基因表示3、串聯(lián)重復(fù)序列不穩(wěn)定第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023164遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第164頁4/25/2023165遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第165頁置換型載體同時(shí)存在正負(fù)兩個(gè)篩選標(biāo)識(shí)，當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí),同源區(qū)發(fā)生雙交換，負(fù)選擇基因?qū)⒈粊G棄;而在隨機(jī)插入時(shí),負(fù)選擇基因也將被插入基因組中,帶有tk基因細(xì)胞會(huì)被培養(yǎng)基中毒性核苷酸類似物代謝產(chǎn)物殺死,這么就能夠篩選出定點(diǎn)整合細(xì)胞。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023166遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第166頁當(dāng)前較多采取是后者：用完全失活或無效打靶基因，取代核基因組上野生型目標(biāo)基因。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023167遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第167頁4/25/2023168遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第168頁4/25/2023169遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第169頁4/25/2023170遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第170頁二者主要區(qū)分在于線性化位點(diǎn)不一樣。置換型載體線性化位點(diǎn)在同源臂外側(cè)，插入型載體線性化位點(diǎn)在同源臂序列內(nèi)部。4/25/2023171遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第171頁第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型“四步走”第一步構(gòu)建打靶載體第二步篩選中靶細(xì)胞第三步囊胚注射和胚胎移植第四步篩選knockout動(dòng)物和表形分析4/25/2023172遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第172頁同源重組分解特定基因定向基因要考慮特定基因產(chǎn)物準(zhǔn)確分析基因載體構(gòu)建：把目標(biāo)基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源DNA分子都重組到帶有標(biāo)識(shí)基因(如neo基因，TK基因等)載體上，成為重組載體。基因敲除是為了使某一基因失去其生理功效，所以普通設(shè)計(jì)為替換型載體。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023173遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第173頁怎樣取得剔除小鼠?-剔除目標(biāo)基因4/25/2023174遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第174頁P(yáng)ositive-NegativeSelectionVector正負(fù)選擇載體Neo抗性基因HSVtk基因4/25/2023175遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第175頁通用型打靶載體Mousegenomelibrary（129strain）篩選出含目標(biāo)基因克隆HRHR選擇適當(dāng)同源區(qū)4/25/2023176遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第176頁1、構(gòu)建打靶載體1）同源序列：常規(guī)打靶載體是在篩選基因兩端加上和目標(biāo)基因同源序列，兩個(gè)同源序列放置必須依據(jù)目標(biāo)基因前后次序而且方向一致，選擇同源序列標(biāo)準(zhǔn)常依據(jù)詳細(xì)對(duì)象和試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)而定第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023177遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第177頁普通兩個(gè)同源序列相加長度要大于5kb，單側(cè)序列大于0.5kb，被刪除目標(biāo)片段長度不宜大于10kb。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2）打靶載體篩選標(biāo)志⑴新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法⑵hprt正負(fù)雙向選擇法⑶正向選擇法4/25/2023178遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第178頁為了更加好地篩選發(fā)生同源重組克隆，1988年Mansour等人設(shè)計(jì)了正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS),處理了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合判別問題。

第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023179遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第179頁⑴新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法①neor：新霉素抗性基因，陽性篩選標(biāo)志，neor基因插入用于打靶外源DNA中，當(dāng)重組后，細(xì)胞能在含新霉素（G418)培養(yǎng)基中生長。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023180遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第180頁②HSV-TK：?jiǎn)渭儼捳畈《拘叵汆奏ぜっ富?，陰性篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023181遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第181頁HSV-TK基因插入外源基因外側(cè)載體序列中。同源重組時(shí)，TK基因通常丟失；隨機(jī)整合時(shí)，TK基因連同打靶載體整合到核基因組上，而同時(shí)取得neo和HSV-TK兩個(gè)基因打靶細(xì)胞，此時(shí)加入更昔洛韋（GCV）可使細(xì)胞死亡。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023182遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第182頁neo-/tk-：無外源基因整合，細(xì)胞在G418中死亡；neo＋/tk＋：隨機(jī)整合，在GCV中死亡；neo＋/tk-：同源重組，在G418和GCV中存活。用G418正向選擇neo，而用GCV負(fù)向選擇HSV-tk第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023183遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第183頁4/25/2023184遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第184頁普通“正負(fù)篩選”置換型基因打靶載體同源序列（總長度5-8kb，斷臂不少于2kb）HSV-tkNeo被刪除靶基因4/25/2023185遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第185頁⑵正負(fù)雙向選擇法（用標(biāo)志基因作匯報(bào)基因）基因打靶經(jīng)典試驗(yàn)慣用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）基因（Xq26.1）作為基因打靶靶基因。內(nèi)源性hprt基因可作為正向和負(fù)向選擇標(biāo)識(shí)基因。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023186遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第186頁hprt＋和hprt－細(xì)胞可分別用HAT（次黃嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基）或6-TG（6-巰基鳥嘌呤）選擇培養(yǎng)基篩選出來。只有hprt＋細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生存，此為正向選擇只有hprt－細(xì)胞能在6-TG培養(yǎng)基中生存，此為負(fù)向選擇第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023187遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第187頁⑶正向選擇法promoterATGneor同源序列1同源序列2同源序列1neor同源序列2同源序列1neor同源序列2以往基因打靶載體正向選擇打靶載體隨機(jī)插入：neo無開啟子和起始密碼子，在G418中死亡同源序列1同源序列2promoterATGtargetgene同源序列1同源序列2promoterATGneor同源重組：neo有開啟子和ATG，在G418中生存4/25/2023188遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第188頁正向選擇打靶基因進(jìn)入細(xì)胞后命運(yùn)①無整合：目標(biāo)載體隨傳代丟失②隨機(jī)整合：則neor無開啟子，neor表示受阻或因整個(gè)位點(diǎn)旁側(cè)基因開啟子作用使neor表示。③同源重組：可借助自然存在靶基因開啟子和AUG使neor高表示用G418篩選抗性細(xì)胞，Southernblot和PCR區(qū)分同源重組和隨機(jī)重組細(xì)胞克隆，G418只需一次篩選。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023189遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第189頁怎樣取得剔除小鼠?－胚胎工程4/25/2023190遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第190頁簡(jiǎn)明過程129系4/25/2023191遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第191頁2、將載體導(dǎo)入ES細(xì)胞選取發(fā)育第4-5天胚胎干細(xì)胞(ES)。把外來基因轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞。體外篩選打靶成功細(xì)胞。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023192遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第192頁3、將基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎4、將10-20個(gè)胚泡植入假孕小鼠子宮。5、取得子代小鼠，篩選帶有靶基因小鼠。常有方法有：Southern印記、Northern印記6、雜合小鼠（+/-）間雜交，取得子二代小鼠（+/+、-/-、+/-）。7、篩選-/-、+/-子二代小鼠。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023193遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第193頁4/25/2023194遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第194頁基因打靶策略第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型完全基因剔除（completeknockout）大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕捉(genetrapping)精細(xì)突變引入時(shí)空上可調(diào)整基因打靶染色體組大片段刪除和重排基因敲入法研制轉(zhuǎn)基因小鼠4/25/2023195遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第195頁完全基因剔除（completeknockout）將陽性選擇標(biāo)識(shí)基因插入到靶基因功效最關(guān)鍵外顯子中，或經(jīng)過同源重組篩除靶基因最主要功效域。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023196遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第196頁大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕捉(genetrapping)基因誘捕(genetrap)是基于小鼠胚胎干細(xì)胞、報(bào)道載體(誘捕載體)建立一個(gè)基因突變方法。誘捕載體在整合位點(diǎn)利用內(nèi)源基因調(diào)控元件模仿內(nèi)源基因表示,使其表示終止,從而能夠說明內(nèi)源基因功效。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023197遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第197頁此法利用一些能隨機(jī)插入基因序列病毒，細(xì)菌或其它基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變細(xì)胞庫，然后經(jīng)過對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)進(jìn)行篩選取得對(duì)應(yīng)基因敲除細(xì)胞。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型依據(jù)細(xì)胞不一樣，插入載體選擇也有所不一樣。

逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于動(dòng)植物細(xì)胞插入；農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子慣用植物細(xì)胞；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除。4/25/2023198遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第198頁建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變ES細(xì)胞庫通?；虿蹲捷d體是一個(gè)無開啟子報(bào)道基因，通常是neo基因；neo基因插入到ES細(xì)胞染色體組中，并利用捕捉基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表示ES克隆能夠很輕易地在含G418選擇培養(yǎng)基中篩選出來。從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活克隆應(yīng)該100％地含有中靶基因。中靶基因信息能夠經(jīng)過篩選標(biāo)識(shí)基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來取得。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023199遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第199頁基因誘捕載體特點(diǎn):①無開啟子②報(bào)道基因上游有一個(gè)剪接收體位點(diǎn)在內(nèi)源性基因順式調(diào)控元件開啟子、增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性作用下,經(jīng)過mRNA前體剪接,上游編碼基因與報(bào)道基因產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄,內(nèi)源性基因表示受阻,報(bào)道基因以內(nèi)源基因模式進(jìn)行表示。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023200遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第200頁4/25/2023201遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第201頁4/25/2023202遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第202頁因?yàn)檎T捕載體及其報(bào)道基因特點(diǎn),基因誘捕技術(shù)可用于高通量生產(chǎn),便于小鼠基因功效大規(guī)模研究,為各類疾病動(dòng)物模型建立奠定良好基礎(chǔ)。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023203遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第203頁利用基因捕捉能夠建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變ES細(xì)胞庫,節(jié)約大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體工作及費(fèi)用,更有效和更快速地進(jìn)行小鼠染色體組功效分析。用基因捕捉法在單次試驗(yàn)中能夠取得數(shù)以百計(jì)帶有單基因剔除ES克隆。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023204遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座第204頁精細(xì)突變引入插入法和置換法共同缺點(diǎn)是靶位點(diǎn)上最終留下了有轉(zhuǎn)錄活性外源標(biāo)識(shí)基因,這對(duì)于研究基因組中愈加精細(xì)、復(fù)雜改變十分不利;如對(duì)于點(diǎn)突變、堿基替換或開啟子、增強(qiáng)子研究來說,在染色體基因定點(diǎn)修飾位置上不留下異源輔助基因是非常必要第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型4/25/2023205遺傳修飾動(dòng)物模型專家講座