第一章當(dāng)代生物技術(shù)一、當(dāng)代生物技術(shù)定義與主要內(nèi)容生物技術(shù)(BiotechnologyorBioengineering）:

對(duì)生物有機(jī)體（微生物至高等動(dòng)、植物）或其組成部分（器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器等），利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、生物信息學(xué)等伎倆，研究、設(shè)計(jì)、改造，以改良生物乃至創(chuàng)造新生物品種一個(gè)技術(shù)體系。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第1頁當(dāng)代生物技術(shù)包含四個(gè)方面：（1）基因工程：生物遺傳物質(zhì)——核酸分離、提取、體外剪切、拼接重組以及擴(kuò)增與表示等技術(shù)。（2）細(xì)胞工程：細(xì)胞（也包含器官或組織）離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及染色體與細(xì)胞器（如線粒體、葉綠體等）移植與改建等操作技術(shù)。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第2頁（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、新裝置，高效優(yōu)質(zhì)地生產(chǎn)特定產(chǎn)品技術(shù)。（4）發(fā)酵工程（微生物工程）：給微生物提供最適宜發(fā)酵條件以生產(chǎn)特定產(chǎn)品技術(shù)。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第3頁

生物技術(shù)依據(jù)和出發(fā)點(diǎn)：生物有機(jī)體種種機(jī)能，是生物在生長、發(fā)育與繁殖過程中進(jìn)行物質(zhì)合成、降解和轉(zhuǎn)化能力（即利用其新陳代謝能力），反應(yīng)器、代謝反應(yīng)、酶、特定遺傳基因關(guān)鍵基礎(chǔ)：基因工程和細(xì)胞工程“工程菌株”或“工程細(xì)胞株”

使酶工程或發(fā)酵工程生產(chǎn)出更多、更加好產(chǎn)品，發(fā)揮出更大經(jīng)濟(jì)效益。酶工程和發(fā)酵工程

當(dāng)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，尤其是發(fā)展大規(guī)模生產(chǎn)最關(guān)鍵步驟。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第4頁二、當(dāng)代生物技術(shù)優(yōu)越性（一）不可取代性植物品種改良雜交育種基因工程改良品種基因資源起源可不受限制牛(豬)

生長激素基因魚

生長、發(fā)育快，體重速增

人血紅蛋白基因豬體內(nèi)

生產(chǎn)人血紅蛋白，分離，可作為人血液替換物。

生長激素釋放抑制因子（抑制生長激素不合時(shí)宜分泌，“肢端肥大癥”特效藥）

50萬個(gè)羊腦

5mg樣品，化學(xué)法300多美元/5mg

基因工程7.5升大腸桿菌發(fā)酵5mg,成本幾十美分。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第5頁（二）快速、準(zhǔn)確試劑盒有效早期診療（遺傳病、病毒引發(fā)疾病和癌癥等）。McAb檢驗(yàn)婦女妊娠比用抗血清法檢驗(yàn)提升了靈敏度，懷孕后8天得知，準(zhǔn)確率100％生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第6頁（三）低耗、高效“酶”催化化學(xué)效應(yīng)，無需高溫、高壓和強(qiáng)酸堿等→大大降低能耗成本、能耗。例：L-蘋果酸生產(chǎn)（生物技術(shù)）產(chǎn)氨短桿菌→搜集菌體→固定化細(xì)胞→→L-蘋果酸原理：延胡索酸→

L-蘋果酸成本比化學(xué)合成降低幾十倍。人生長激素（治療侏儒?。┮粋€(gè)患者每年需用量

50個(gè)死人垂體中提取基因工程生產(chǎn)價(jià)格為1／4提取，不需依賴死人腦。

生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第7頁（四）副產(chǎn)物少、不良反應(yīng)小、安全性好疫苗生產(chǎn)常規(guī)方法用血液，成本高，可帶來病毒感染危險(xiǎn)性。當(dāng)代生物技術(shù)用大腸桿菌如乙肝疫苗，凝血因子等→大大改進(jìn)使用安全性。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第8頁2.“生物導(dǎo)彈”

McAb接抗癌藥品→體內(nèi)McAb只與該腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合→抗癌藥品專一、靶向到腫瘤細(xì)胞小鼠免疫球蛋白

McAb免疫球蛋白分子中含有些人免疫球蛋白分子片段三、當(dāng)代生物技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用（—）在疾病診療與治療中應(yīng)用1.單克隆抗體與疾病診療妊娠試驗(yàn)

FDA同意上市McAb產(chǎn)品

已經(jīng)有幾十種。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第9頁3.基因診療

核酸分子雜交技術(shù)

80年代中期聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）體外擴(kuò)增基因方法產(chǎn)前和癥狀前基因診療:苯丙酮尿癥、珠蛋白合成障礙性貧血、假肥大型肌營養(yǎng)不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊腎、慢性進(jìn)行性舞蹈病等遺傳病4.基因治療因單一結(jié)構(gòu)基因即編碼蛋白質(zhì)基因缺點(diǎn)所引發(fā)遺傳病。治療:導(dǎo)入正?；颉Ｕ秉c(diǎn)基因引發(fā)DNA代謝異常及細(xì)胞突變→使之恢復(fù)正常功效。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第10頁（二）未來醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中生物技術(shù)展望轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)“轉(zhuǎn)基因藥品”

1978年把人tPA基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠并證實(shí)在其乳汁中能得到tPA

美國DNx企業(yè)“制藥工廠”轉(zhuǎn)基因豬環(huán)球基因藥品企業(yè)轉(zhuǎn)基因奶?；蛎钙髽I(yè)

轉(zhuǎn)基因山羊英國藥品蛋白企業(yè)

轉(zhuǎn)基因綿羊“轉(zhuǎn)基因藥品”與基因工程藥品相比,

產(chǎn)量高，成本低,含有與人體本身產(chǎn)生蛋白相同生物學(xué)活性。乳腺細(xì)胞能進(jìn)行一系列翻譯后修飾作用，包含糖基化作用等，正確地產(chǎn)生人體蛋白。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第11頁2.人型McAb(monoclonalantibody)制備技術(shù)路線：

鼠型McAb分子中更換一段人抗體分子中與抗原結(jié)合鏈段（用蛋白質(zhì)工程方法）；

從人鼠雜交瘤細(xì)胞中直接克隆人抗體基因，并使之在細(xì)菌中得到表示；

將人免疫球蛋白重鏈C區(qū)基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠，用特定抗原免疫→得人型化McAb。3.基因治療“基因打靶”技術(shù)將外源基因定點(diǎn)整合到細(xì)胞基因組某一確定位點(diǎn)上，因而能對(duì)缺點(diǎn)基因進(jìn)行原位修復(fù)。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第12頁聚合酶鏈反應(yīng)及其它不停涌現(xiàn)分子生物學(xué)新技術(shù)將得到廣泛應(yīng)用。在細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等不一樣細(xì)胞內(nèi)能得到高效表示載體將不停地構(gòu)建成功，大幅提升基因工程生產(chǎn)效率。生物技術(shù)后處理工程和蛋白質(zhì)工程將快速發(fā)展有目標(biāo)地修飾、改造乃至重新組建4.生物技術(shù)各個(gè)步驟生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第13頁第一節(jié)生物藥品(biopharmaceutics)一、概念利用生物體及其成份綜合利用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、生物組織免疫學(xué)、物理化學(xué)、藥學(xué)原理、方法加工制造預(yù)防診療疾病制品治療第二章生物藥品與生物技術(shù)藥品概述生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第14頁（一）按起源和制造方法1.動(dòng)物起源動(dòng)物臟器資源豐富家畜：豬、馬、牛、羊家禽：雞、鴨海洋生物：海帶、鯊魚、海蛇二、分類生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第15頁2.微生物起源發(fā)酵法優(yōu)點(diǎn)：1）微生物及其代謝物資源豐富、開發(fā)潛力大2）培養(yǎng)、繁殖快、產(chǎn)量高、成本低，便于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，不受原料、運(yùn)輸、保留、季節(jié)和資源供給影響3）生產(chǎn)生物藥品可綜合利用代謝物和菌絲體;誘變選育良種;加入前體培養(yǎng)法4）體內(nèi)酶轉(zhuǎn)化作用，使復(fù)雜、難反應(yīng)能專一、快速

生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第16頁4.化學(xué)合成氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、維生素、激素結(jié)構(gòu)改造以高效，長期有效和高專一性3.植物起源植物中蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸等生物大分子研究和利用生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第17頁5.當(dāng)代生物技術(shù)產(chǎn)品基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組活性多肽活性蛋白質(zhì)類基因工程疫苗

McAb

各種細(xì)胞生長因子利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物生產(chǎn)生物藥品利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造天然蛋白質(zhì)創(chuàng)造自然界沒有而功效上更優(yōu)良蛋白質(zhì)類生物藥品生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第18頁生物技術(shù)藥品（基因工程藥品，BiotechDrugs）:以DNA重組技術(shù)（包含基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)）生產(chǎn)蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細(xì)胞生長因子類藥品。細(xì)胞因子干擾素類：IFN-、IFN-β和IFN-。

IFN-有

lb，

2a，

2b等2.細(xì)胞因子白介素類和腫瘤壞死因子類：IL-2和突變型白介素-2；TNF-和TNF受體。二、生物技術(shù)藥品主要類型第二節(jié)生物技術(shù)藥品一、概念生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第19頁3.造血系統(tǒng)生長因子類：粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、紅細(xì)胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO)、干細(xì)胞生長因子（SCF）等。4.生長因子類：促進(jìn)細(xì)胞生長、組織再生和創(chuàng)傷治療。胰島素樣生長因子（ICF）、表皮生長因子（ECF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-與TGF-β）、神經(jīng)生長因子（NGF）及各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。5.重組蛋白質(zhì)與多肽類激素：人重組胰島素（Humulin）、人生長激素（rhGH）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、絨毛膜促性腺激素（HCG）等。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第20頁6.心血管病治療劑與酶制劑：心血管疾病和抗腫瘤治療Ⅶ因子、水蛭素、組織纖溶酶原激活劑（tPA）、尿激酶、鏈激酶、葡激酶、門冬酰胺酶、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖腦苷酶及DNase等。7.重組疫苗與單抗制品：重組乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重組乙肝表面抗原疫苗、CHO細(xì)胞）、艾滋病疫苗和腫瘤疫苗等。己開發(fā)McAb有72種，多用于治療難治性疾病如預(yù)防移植物急性排斥、免疫性疾病和腫瘤等。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第21頁8.基因藥品：應(yīng)用于基因治療目標(biāo)DNA片段重組藥品?；蛑委?將外源基因?qū)霗C(jī)體以到達(dá)治療疾病目標(biāo)。遺傳性疾病、腫瘤、艾滋病、囊性纖維變性、糖尿病和心血管病等。

我國已同意上市品：IFN-1b（自研），IFN-2a，IFN-2b，IFN-，IL-2，IL-2－125Ser，G-CSF，GM-CSF，SK，EPO，EGF，ECF衍生物，b-ECF，胰島素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8單抗乳膏劑，胸苷激酶基因工程細(xì)胞制劑，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第22頁細(xì)胞:生物有機(jī)體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)基本單位。第三章細(xì)胞工程技術(shù)概念細(xì)胞工程：以細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科原理與方法，按照人們意志設(shè)計(jì)改造細(xì)胞一些遺傳性狀，培育出新生物改良品種或經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)取得自然界中難以取得寶貴產(chǎn)品新興生物技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞重組和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移等生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第23頁第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)：生物體內(nèi)某一塊組織，用酶消化法分散成單個(gè)細(xì)胞，接種至特定培養(yǎng)容器中并給予必要生長條件，使其在體外生長繁殖技術(shù)。細(xì)胞生長所需培養(yǎng)條件：1.足夠營養(yǎng)，糖、氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等；2.生長環(huán)境，適當(dāng)溫度、pH值、無菌條件。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第24頁動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：先在無菌條件下用消化酶將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，使其在體外適當(dāng)條件下生長繁殖技術(shù)。一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)象單個(gè)細(xì)胞，組織培養(yǎng)對(duì)象組織塊（0.5～1mm），器官培養(yǎng)對(duì)象器官一部分或整個(gè)器官。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第25頁動(dòng)物細(xì)胞分類：（－）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特征貼壁依賴性細(xì)胞貼壁大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞非貼壁依賴性細(xì)胞懸浮血液淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系兼性貼壁細(xì)胞附壁或懸浮生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第26頁1.原代培養(yǎng)（or首次培養(yǎng)，primaryculture）胚胎或出生后幾天幼齡動(dòng)物臟器獲取組織，剪成小塊長寬1mm、厚約0.5mm，胰酶消化分散，稀釋成2×105～7×105／ml，分裝到培養(yǎng)瓶（板）于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞特點(diǎn)：離體時(shí)間短，普通具二倍體遺傳性狀，能很好地反應(yīng)在體內(nèi)生長情況

適適用作藥品測試和細(xì)胞分化研究工具。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第27頁2．傳代培養(yǎng)（或繼代培養(yǎng)，subculture）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)接分裝到≥兩個(gè)瓶中培養(yǎng)傳代培養(yǎng)。

分裂次數(shù)：正常細(xì)胞有限普通人正常細(xì)胞可傳代50～60次有限細(xì)胞系（finitecellline），傳代過程中可無限制生長繁殖細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系（continuouscellline）或已確立細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第28頁（三）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)營養(yǎng)條件1.培養(yǎng)基1）天然培養(yǎng)基成份復(fù)雜、起源有限血清、水解乳蛋白、膠原、胚胎浸液等。

主含蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、其它對(duì)維持細(xì)胞生長繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)活性不可缺乏未知因子，促進(jìn)細(xì)胞貼壁、中和有毒物質(zhì)以保護(hù)細(xì)胞。動(dòng)物血清：缺點(diǎn)：起源困難，成份不確定，使得細(xì)胞生長過程不易檢測控制。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第29頁水解乳蛋白乳白蛋白水解產(chǎn)物膠原動(dòng)物真皮（豚鼠、牛）或大鼠尾腱起源組織提取物

胚胎浸液雞胚和牛胚生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第30頁特點(diǎn)：一定化學(xué)組成主要組分：氨基酸、維生素、糖、無機(jī)鹽、其它一些輔助因子。2.合成培養(yǎng)基依據(jù)天然培養(yǎng)基成份，人工設(shè)計(jì)模擬合成RPMI-1640、DMEM、TC199、Eagle’sMEM等。只能維持細(xì)胞生存(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)

須補(bǔ)充部分天然培養(yǎng)基，血清普通為10％～20%。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第31頁①維持細(xì)胞生長所需激素和生長因子胰島素、生長激素、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子②細(xì)胞貼壁或鋪展所需細(xì)胞因子，纖維粘連素、鋪展因子、胎球蛋白等；血清在培養(yǎng)液中主要作用：提供③識(shí)別維生素、脂類、激素和金屬結(jié)合蛋白，調(diào)整被結(jié)合物活力白蛋白與維生素、脂類、激素結(jié)合，將它們載入細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并傳遞鐵離子，結(jié)合蛋白與有毒金屬或熱原結(jié)合則可解除它們毒性；④細(xì)胞生長所需脂肪酸與微量元素磷脂質(zhì)、膽固醇、前列腺素等，銅、鋅等；生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第32頁⑤蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害；⑥起緩沖作用，確保培養(yǎng)液pH穩(wěn)定。不足：成份復(fù)雜，含已知或未知成份，研究激素、細(xì)胞因子及藥品作用時(shí)，干擾分析；產(chǎn)品生產(chǎn)增加細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)物提取難度，或影響產(chǎn)品質(zhì)量；大規(guī)模培養(yǎng)成本過高。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第33頁①消除因不一樣批次血清之間差異而造成試驗(yàn)誤差，確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性；②降低血清中可能存在支原體、病毒所造成污染；3.無血清培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)與含有血清培養(yǎng)基相比③產(chǎn)品分離純化愈加輕易，簡化判定細(xì)胞工程產(chǎn)品程序；④起源穩(wěn)定，供給充分。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第34頁無血清培養(yǎng)基組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+替換血清作用補(bǔ)充成份。1．激素和生長因子：激素胰島素、胰高血糖素、生長激素等多肽激素及孕酮、氫化可松、雌二醇等甾體類激素。胰島素調(diào)整和控制細(xì)胞內(nèi)各種代謝路徑，加強(qiáng)糖原、蛋白質(zhì)、甘油三酯及DNA合成。生長因子表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維生長因子、血小板生長因子等。補(bǔ)充成份種類：生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第35頁2.結(jié)合蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白增強(qiáng)細(xì)胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵能力，可結(jié)合有毒金屬離子解除其毒性；白蛋白與脂類、金屬離子、激素等結(jié)合后能夠增強(qiáng)其作用，刺激細(xì)胞增殖。3.貼壁和鋪展因子：慣用貼壁因子有纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸、膠原，血清鋪展因子則是一個(gè)糖蛋白。 4.低分子量營養(yǎng)因子和元素：主要有維生素A、抗壞血酸、-生育酚、硒等生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第36頁（四）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌；適當(dāng)溫度、濕度、氣體環(huán)境和pH值。1.培養(yǎng)環(huán)境無毒無菌：動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)強(qiáng)大免疫系統(tǒng)，去除和抵抗病原體→免受侵害

體外培養(yǎng)失去抵抗能力確保環(huán)境無毒無菌(首要條件)

加雙抗液青霉素、鏈霉素以抑制可能存在細(xì)菌和霉菌生長生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第37頁2．溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞35～37℃，動(dòng)物細(xì)胞耐低溫能力強(qiáng)于耐高溫能力，

＞41℃

細(xì)胞嚴(yán)重受損，

＜4℃細(xì)胞也能存活數(shù)日。培養(yǎng)物+保護(hù)劑[二甲亞砜（DMSO）或甘油]-80℃或液氮罐（溫度可降至-196℃）可長久保留。3．滲透壓：哺乳動(dòng)物細(xì)胞260～320mOsm／kg

滲透壓可略低培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)滲透壓↑生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第38頁4．氣體環(huán)境與pH：普通為95％空氣+5%CO2，

O2

參加三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長，

CO2

細(xì)胞生長所必需成份，細(xì)胞代謝產(chǎn)物，維持培養(yǎng)液pH。大多數(shù)細(xì)胞生長適宜pH是7.2～7.4NaHCO3

細(xì)胞培養(yǎng)過程中不停釋放出CO2，使培養(yǎng)液變酸，添加一定量NaHCO3碳酸鹽緩沖系統(tǒng)維持培養(yǎng)液pH值相對(duì)穩(wěn)定生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第39頁（五）動(dòng)物細(xì)胞種質(zhì)保留與運(yùn)輸超低溫冰凍方法長久保留細(xì)胞凍存液中加入保護(hù)劑DMSO或甘油，將細(xì)胞密封保留于-80℃或-196℃液氮罐中。1.保護(hù)劑甘油或DMSO，速滲透入胞內(nèi)結(jié)合H2O，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，同時(shí)增加胞膜對(duì)水通透性，使H2O在凍結(jié)前遲緩?fù)赋霭?，降低胞?nèi)冰晶，降低因冰晶形成而造成胞損傷。使用濃度甘油5％～20％，DMSO5％～10％。影響細(xì)胞凍存質(zhì)量原因：生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第40頁DMSO

與甘油相比，作用更加快，膜通透性更強(qiáng)，抗凍傷能力也更強(qiáng)，細(xì)胞在DMSO中30秒即可到達(dá)細(xì)胞內(nèi)外平衡（甘油需2h）試驗(yàn)室普遍采取。2.細(xì)胞懸液凍存速度:降低凍存速度使冰晶盡可能在胞外形成，降低胞內(nèi)冰晶形成→降低對(duì)細(xì)胞傷害。先緩降至一定溫度，如-30℃，使胞外凍結(jié)，胞內(nèi)脫水，再快速降溫。3.凍存后用液氮超低溫保藏-150℃～-196℃，細(xì)胞全部理化活動(dòng)均降至最低程度，或忽略不計(jì)長久儲(chǔ)存。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第41頁4.細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)融化速度。細(xì)胞凍存管,取出快速升溫→胞外結(jié)晶在短時(shí)間內(nèi)融化防止因遲緩融化而使水分滲透胞內(nèi)再次形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害。操作：取出后馬上投入到37～38℃水浴。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第42頁大規(guī)模培養(yǎng)：在人工條件下高密度大量培養(yǎng)特定動(dòng)物細(xì)胞從而生產(chǎn)寶貴醫(yī)藥產(chǎn)品技術(shù)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)。產(chǎn)品：疫苗、激素、細(xì)胞因子、單克隆抗體等。（六）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第43頁1.培養(yǎng)基與試驗(yàn)室培養(yǎng)基基本一致（除用無血清培養(yǎng)基外）。無血清培養(yǎng)基中難生長細(xì)胞→采取漸適法馴化細(xì)胞→使適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長。*無血清培養(yǎng)液中易出現(xiàn)細(xì)胞毒（與水中微量元素或有機(jī)物污染相關(guān)）→制備培養(yǎng)液須用高純水，經(jīng)0.22m微孔濾膜過濾除菌。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第44頁培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)，貼壁-懸浮培養(yǎng)。（1）懸浮培養(yǎng)非貼壁依賴性細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞氣升式生物反應(yīng)器或通氣攪拌式反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞胞膜薄，嬌嫩易碎，抗剪切能力弱氣升式反應(yīng)器工作原理：經(jīng)過氣體上下循環(huán)起到供氧以及攪拌效果。培養(yǎng)規(guī)模5L、30L、100L到1000L2．動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)而微生物可用攪拌式發(fā)酵罐生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第45頁（2）貼壁培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)）貼壁依賴性細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶（滾瓶）培養(yǎng)培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)使吸附在瓶壁上細(xì)胞交替與培養(yǎng)液及空氣接觸而增加細(xì)胞吸附面積。優(yōu)點(diǎn)：普遍適合用于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)，規(guī)模較易放大，輕易實(shí)現(xiàn)罐流培養(yǎng)(及時(shí)放出陳舊培養(yǎng)液，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液)。缺點(diǎn)：操作較為繁瑣，傳代或放大時(shí)需要用蛋白酶將其從瓶壁上消化下來。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第46頁（3）微載體培養(yǎng)

基本原理：將細(xì)胞附著在微載體表面，后置于培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在載體表面單層生長繁殖。商品微粒:DEAE-交聯(lián)葡聚糖、二甲氨丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）及聚苯乙烯（Biosilon）等市售。優(yōu)點(diǎn)：①細(xì)胞附著表面積增大；②細(xì)胞生長環(huán)境均一，條件易于控制；③取樣及細(xì)胞計(jì)數(shù)簡單；④細(xì)胞與培養(yǎng)液易于分離；⑤大規(guī)模培養(yǎng)只需對(duì)微生物發(fā)酵罐或氣升式深層培養(yǎng)系統(tǒng)稍加改進(jìn)即可；⑥適合于培養(yǎng)原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株以及基因重組細(xì)胞。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第47頁（4）固定化包埋培養(yǎng)與微囊培養(yǎng)固定化包埋培養(yǎng)(大載體培養(yǎng))

用高分子材料將細(xì)胞包埋并制成固定化顆粒，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)。海藻酸鈣包埋:

細(xì)胞溶液與海藻酸鈉溶液混合，經(jīng)過噴珠裝置將其噴入氯化鈣溶液→直徑約2.6mm固定化顆粒，去除氯化鈣溶液，通入培養(yǎng)液培養(yǎng)。海藻酸鈉分子中含有重復(fù)排列葡糖醛酸和甘露糖酸與鈣離子作用后形成網(wǎng)絡(luò)狀凝膠珠，而將細(xì)胞包埋于其中。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第48頁微囊培養(yǎng)：細(xì)胞包被在薄半透性膜中

采取海藻酸鈉包埋細(xì)胞制成固定化凝膠顆粒，再用長鏈氨基酸聚合物、多聚賴氨酸包被形成堅(jiān)韌、多孔可通透外膜。液化膠化小珠，使其成膠物質(zhì)從多孔膜流出，活細(xì)胞或生物活性物質(zhì)留在多孔外膜內(nèi)，置氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行增殖。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第49頁（5）中空纖維培養(yǎng)數(shù)千根中空纖維封存于特制圓筒里，組成一個(gè)中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。

“內(nèi)室”

→灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長；

“外室”

→細(xì)胞貼附于管壁上，吸收從“內(nèi)室”滲透出來養(yǎng)分，快速生長繁殖。單抗等細(xì)胞分泌大分子量物質(zhì)只能留在外室，且不停被濃縮。搜集產(chǎn)物打開“外室”總出口代謝廢物為小分子物質(zhì)，滲進(jìn)內(nèi)室，從其出口流出，不對(duì)外室細(xì)胞產(chǎn)生毒害生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第50頁優(yōu)點(diǎn)：①培養(yǎng)器體積小，細(xì)胞密度高；②產(chǎn)物濃度高、純度高；③自動(dòng)化程度高，細(xì)胞生長周期長。缺點(diǎn)：價(jià)格較貴。（5）中空纖維培養(yǎng)生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第51頁第二節(jié)細(xì)胞融合

離體條件下用人工將兩或多個(gè)不一樣種細(xì)胞經(jīng)過無性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞過程融合后細(xì)胞含兩或多個(gè)不一樣細(xì)胞核（異核體），隨即細(xì)胞有絲分裂中，有些不一樣胞核染色體合并到一個(gè)核中→單核雜種細(xì)胞，而不能形成單核融合細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐步死亡。細(xì)胞融合(體細(xì)胞雜交):法國Barski1960年過程：細(xì)胞在促融因子作用下發(fā)生凝集現(xiàn)象，胞間質(zhì)膜粘連，細(xì)胞融合，在培養(yǎng)過程中核融合雜種細(xì)胞。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第52頁1）細(xì)胞準(zhǔn)備貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，兩親本細(xì)胞混合培養(yǎng)懸浮細(xì)胞制成一定濃度懸液；2）誘導(dǎo)融合需要添加促融劑誘導(dǎo)融合；一、動(dòng)物細(xì)胞融合小鼠和田鼠，小鼠和小雞，小鼠和人遠(yuǎn)緣和超遠(yuǎn)緣體細(xì)胞雜交。1、動(dòng)物細(xì)胞融合基本過程3）雜種細(xì)胞選擇利用選擇性培養(yǎng)基，使親本細(xì)胞死亡而讓雜種細(xì)胞存活；4）雜種細(xì)胞克隆選擇與純化雜種細(xì)胞，再經(jīng)培養(yǎng)得所需要無性繁殖系。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第53頁2.促融劑（1）病毒：仙臺(tái)病毒(滅活)

兩種不一樣動(dòng)物細(xì)胞混合物中存在大劑量病毒,即細(xì)胞周圍充滿病毒，病毒或其組分在細(xì)胞間起粘連作用使細(xì)胞聚集成團(tuán)→不一樣胞膜蛋白及膜脂質(zhì)分子重新排布而結(jié)合成一個(gè)整體。誘導(dǎo)細(xì)胞融合關(guān)鍵使細(xì)胞膜蛋白重新分布膜中脂質(zhì)分子重排生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第54頁（2）PEG誘導(dǎo)：當(dāng)不一樣種屬動(dòng)物細(xì)胞混合液中存在PEG時(shí)即產(chǎn)生細(xì)胞凝集作用，在稀釋和除去PEG過程中即產(chǎn)生融合現(xiàn)象。原理：脫水作用→細(xì)胞凝集，使膜結(jié)構(gòu)改變，改變膜表面電荷或膜電位→膜蛋白顆粒聚集及脂層分子重排所致。特點(diǎn)：使用簡便、結(jié)果穩(wěn)定、誘導(dǎo)融合率較高等選?。悍肿恿?000～4000，濃度30%～50％生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第55頁（3）電場脈沖：將兩種細(xì)胞混合液經(jīng)10～100V／cm低強(qiáng)度非均勻交變電場作用，極化成偶極子而相互吸引緊密接觸排列成串，此時(shí)對(duì)該狀態(tài)細(xì)胞施加瞬時(shí)高強(qiáng)度電脈沖，普通擊穿電壓為0.5～10kV／cm，作用時(shí)間為30～50s，細(xì)胞之間形成穩(wěn)定膜連接（可逆性電擊穿），不一樣細(xì)胞間膜脂質(zhì)分子重排而合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞。融合率高，可控性好。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第56頁3.雜種細(xì)胞篩選融合后細(xì)胞（五種）異型融合細(xì)胞（雙核和多核）、兩種同型融合細(xì)胞（雙核和多核）、未發(fā)生融合兩種親本細(xì)胞。（1）篩選原理篩選目標(biāo)：獲遺傳性狀比親本細(xì)胞更優(yōu)良雜種細(xì)胞。篩選原理：在培養(yǎng)過程中利用選擇性培養(yǎng)基，殺死四種類型細(xì)胞。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第57頁（2）選擇系統(tǒng)慣用：HAT選擇系統(tǒng)、抗藥性選擇系統(tǒng)及營養(yǎng)缺點(diǎn)型選擇系統(tǒng)。HAT選擇系統(tǒng)：含一定數(shù)量次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）選擇性培養(yǎng)基。

DNA為絕大多數(shù)生物遺傳物質(zhì)。嘌呤核苷及嘧啶核苷是DNA主要組成部分，是細(xì)胞生長必需成份。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第58頁補(bǔ)救合成路徑：細(xì)胞從培養(yǎng)液或本身代謝產(chǎn)物中吸收游離嘌呤或嘧啶合成DNA。正常細(xì)胞中DNA合成路徑全合成路徑：細(xì)胞利用簡單外源性小分子物質(zhì)從頭合成路徑；生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第59頁圖細(xì)胞中DNA合成路徑生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第60頁次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺點(diǎn)型（HPRT-）細(xì)胞嘧啶全合成+補(bǔ)救合成嘌呤全合成胸腺嘧啶核苷激酶缺點(diǎn)型（TK-）細(xì)胞嘌呤全合成+補(bǔ)救合成嘧啶全合成慣用親本細(xì)胞：酶缺點(diǎn)型細(xì)胞不能分裂淋巴細(xì)胞。HPRT-及TK-細(xì)胞無嘌呤或嘧啶補(bǔ)救合成路徑全合成需甲基（胞中由二氫葉酸還原酶作用而生）DNA合成兩條路徑均受抑制，親本細(xì)胞（HPRT-及TK-）在培養(yǎng)過程中死亡。含氨基蝶呤培養(yǎng)基生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第61頁細(xì)胞融合物在HAT培養(yǎng)基上選擇結(jié)果圖生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第62頁同一藥品對(duì)不一樣種類細(xì)胞作用差異。一個(gè)親本細(xì)胞對(duì)A藥品敏感，而對(duì)B藥品不敏感；另一個(gè)親本細(xì)胞對(duì)B藥品敏感，而對(duì)A藥品不敏感。一定量A、B于培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞兩種親本細(xì)胞被殺死，融合細(xì)胞存活，抗藥性選擇系統(tǒng)：生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第63頁營養(yǎng)缺點(diǎn)型篩選：有些細(xì)胞在一些營養(yǎng)物（如氨基酸、糖、嘌嶺、嘧啶或維生素等）合成能力上出現(xiàn)缺點(diǎn)→難在缺乏這種營養(yǎng)成份培養(yǎng)基中存活（該營養(yǎng)營養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)胞）。親本細(xì)胞色氨酸缺點(diǎn)型，蘇氨酸缺點(diǎn)型，選擇性培養(yǎng)基中不加入色氨酸和蘇氨酸只有融合所形成雜種細(xì)胞才能生長。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第64頁4.雜種細(xì)胞表型雜種細(xì)胞（與親本細(xì)胞相比）在遺傳表型上改變：１）互補(bǔ)作用：兩親本細(xì)胞一些生物學(xué)特征在雜種細(xì)胞中共同表示現(xiàn)象。免疫淋巴細(xì)胞分泌抗體，體外培養(yǎng)不能生長；小鼠骨髓瘤細(xì)胞體外生長。雜種細(xì)胞既體外生長又分泌特定抗體。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第65頁２）激活作用：某一親本細(xì)胞不活動(dòng)基因在雜種細(xì)胞中被激活現(xiàn)象。HPRT-及HPRT+人細(xì)胞分別與HPRT-小鼠細(xì)胞雜交，兩種雜種細(xì)胞均顯示出正常小鼠HPRT酶活性，人細(xì)胞含有激活小鼠細(xì)胞HPRT基因作用。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第66頁３）消失作用：親本某一或一些性狀在雜種細(xì)胞中消失現(xiàn)象。金黃色倉鼠黑色素瘤細(xì)胞很高多巴氧化酶活性，可催化酪氨酸形成黑色素，但與不產(chǎn)生黑色素小鼠成纖維細(xì)胞融合雜種細(xì)胞不產(chǎn)生黑色素表明多巴氧化酶基因在雜種細(xì)胞中被抑制而呈隱性。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第67頁４）激活與消失作用：雜種細(xì)胞中出現(xiàn)同一親本細(xì)胞某一些非活動(dòng)基因被激活，而另一些遺傳性狀同時(shí)消失現(xiàn)象。小鼠胚胎發(fā)育早期胸腺細(xì)胞能表示t12抗原，但成年后不表示t12抗原而表示H-2抗原，說明其帶有t12和H-2兩種抗原基因，但在不一樣發(fā)育階段不一樣基因之間表示存在差異。當(dāng)成年小鼠胸腺細(xì)胞與小鼠胚胎性癌細(xì)胞融合所形成雜種細(xì)胞中，H-2抗原基因呈隱性，而t12抗原基因呈顯性。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第68頁兩種親本細(xì)胞遺傳物質(zhì)融合在一個(gè)細(xì)胞中后，一些遺傳物質(zhì)經(jīng)過一段時(shí)間后可能會(huì)逐步消失，其結(jié)果是由該基因所控制性狀也就隨之消失。遺傳物質(zhì)即使存在，但在雜種細(xì)胞中能夠表現(xiàn)出其基因性狀（顯性），也可能不表現(xiàn)出其基因性狀（隱性）。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第69頁細(xì)胞重組：在體外條件下利用一定試驗(yàn)技術(shù)從活細(xì)胞中分離出各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組成“部件”，再把它們?cè)诓灰粯蛹?xì)胞之間重新進(jìn)行裝配，而得到新生物活性細(xì)胞。第三節(jié)細(xì)胞重組（celleconstruction）一、核移植技術(shù)（nucleartransplantation）借助顯微操作儀，利用微吸管將一個(gè)細(xì)胞細(xì)胞核吸出并移植到另一個(gè)去核細(xì)胞中。最初魚類和兩棲類動(dòng)物后擴(kuò)展到高等哺乳動(dòng)物小鼠和家養(yǎng)動(dòng)物等生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第70頁二、細(xì)胞器移植細(xì)胞器種類很多，分離與純化也較輕易，不過研究較多是葉綠體和線粒體移植。（一）葉綠體移植：葉綠體進(jìn)行光合作用，把太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能。

高光合效率作物葉綠體轉(zhuǎn)移到低光合效率作物中增產(chǎn)。葉綠體移植方法：將分離純化葉綠體與原生質(zhì)體一道培養(yǎng)，經(jīng)過細(xì)胞胞飲作用將葉綠體攝入原生質(zhì)體，經(jīng)過培養(yǎng)，原生質(zhì)體再發(fā)育成完整植株生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第71頁（二）線粒體移植：線粒體有自己遺傳基因，能夠合成一些蛋白質(zhì)。線粒體移植，可傳遞遺傳信息，改變受體細(xì)胞一些特征，如抗藥性和雄性不育性等。

移植方法：微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞飲攝入等。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第72頁第四節(jié)單克隆抗體技術(shù)外源性物質(zhì)侵入人體或動(dòng)物體時(shí)免疫反應(yīng)。即，B淋巴細(xì)胞激活、增殖、分化成漿細(xì)胞抗體（體液免疫）（血清、體液、外分泌液）。取得一定特異性抗體經(jīng)典方法：

用抗原免疫動(dòng)物（如兔、馬、羊、鼠等），從其血清中進(jìn)行分離。

多個(gè)抗原表位（決定簇）針對(duì)各種抗原表位混合抗體（多克隆抗體）。生物技術(shù)制藥專業(yè)專家講座第73頁缺點(diǎn)：

1、抗體不均一，特異性差，效價(jià)低，用于檢測會(huì)影響檢測準(zhǔn)確性和靈敏度；

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