1試驗03

植物組織中還原糖含量測定

（斐林試劑比色法）生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第1頁2脫色程度與溶液中還原性糖含量成正比關(guān)系。在590nm波長下比色測定吸光度，依據(jù)吸光度降低值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算出所測樣品中還原糖含量。一、原理植物組織中可溶性糖可分為還原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非還原糖（主要是蔗糖）兩類。還原糖含有自由醛基和酮基，含有還原性。在堿性、加熱條件下，還原基團能把斐林試劑中CuSO4Cu2＋還原成Cu＋，生成Cu2O紅色沉淀，藍(lán)色斐林試劑溶液因失出部分Cu2＋而脫色。生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第2頁3

材料：新鮮植物葉片

儀器設(shè)備：分光光度計、分析天平、低速離心機、水浴鍋等

試劑：

1.斐林試劑A液：40gCuSO4·5H2O溶解于蒸餾水定容至1.0L。

2.斐林試劑B液：200g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·5H2O）與150gNaOH溶于蒸餾水中，并定容至1.0L。

A、B兩液分別貯存，使用前按1：1體積混合。

（已配好）二、材料、儀器設(shè)備及試劑

生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第3頁4

0.1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

烘干純葡萄糖100.00mg，加蒸餾水溶解定容至100ml

濃度：1.00mg/ml

（已配好）斐林試劑（藍(lán)色）Cu2O磚紅色不溶于水生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第4頁5三、試驗方法與步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取5支試管編號，按下表分別加入各試劑。項目123451.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（ml）0.002.004.006.00樣品液

6ml2.H2O(ml)6.004.002.000.000.00每管葡萄糖含量(mg)0.002.004.006.00

待測3.斐林試劑量(ml)4.004.004.004.004.00

A590值A(chǔ)1A2A3A4A5

吸光值差值(ΔA590

)A1-A1A1-A2A1-A3A1-A4A1-A5生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第5頁6處理方法：

加斐林試劑后搖勻，加蓋沸水浴中15min，自然冷卻轉(zhuǎn)入離心管，平衡后放入離心機?。‰x心：2500r/min5min

小心取出，取上清液測吸光值生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第6頁7標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以葡萄糖量(mg)為橫座標(biāo)，吸光度差值(ΔA590

）為縱座標(biāo)，在座標(biāo)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。比色測定：

用H2O作調(diào)0空白參比液！

在590nm波長下測定各管吸光度。

ΔA590葡萄糖mg0生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第7頁83.0～4.0g樣品—→加水研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入50ml大試管—→80℃水浴20min（間歇震蕩）—→冷卻后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶定容、過濾后得到待測溶液。

取待測液6.0ml進行測定（按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟）。2樣品還原糖提取與測定生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第8頁9W=g；VT=100ml;Vs=6ml;A590及ΔA590填入工作曲線表作式作曲線圖由工作曲線查得樣品還原糖含量為C=?mg四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第9頁10樣品還原糖含量（%）＝五、結(jié)果計算

（X：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖質(zhì)量mg；VT：提取液總體積（mL）；W：樣品鮮質(zhì)量（g）；Vs：測定時取用樣品體積（mL）；N：樣品稀釋倍數(shù)）生化實驗斐林試劑比色法測還原糖含量專家講座第10頁112種