生命中的螺旋結構精彩人生螺旋式上升目前一頁\總數七十四頁\編于八點第二章基因克隆載體的種類和特性目前二頁\總數七十四頁\編于八點基因工程的基本條件A目的基因（從特定的生物基因組或cDNA中通過各種方法分離和擴大繁殖獲得足夠量的目的基因或cDNA序列）B用于基因克隆的載體（合適的載體，并對載體DNA進行克隆，制備足夠量又達到一定純度的載體DNA）C用于核酸操作的工具酶D用于基因轉移的受體菌或細胞（宿主細胞）（能攝取外源重組DNA并使其穩(wěn)定維持和表達，或有待于實施遺傳改良的細胞）目前三頁\總數七十四頁\編于八點一、載體的功能、特征及種類載體（vector)：攜帶外源基因(或DNA片段)進入受體細胞（復制、整合或表達）的工具。使用載體的目的基因的復制擴增基因的表達基因的整合基因的調控其他目前四頁\總數七十四頁\編于八點1、載體的功能（1）運送外源基因高效轉入受體細胞（2）為外源基因提供復制能力或整合能力（3）為外源基因的擴增或表達提供條件目前五頁\總數七十四頁\編于八點2、載體應具備的條件（1）具有對受體細胞的可轉移性（2）具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點（3）長度盡可能小，以提高其載裝能力（4）具有多種單一的核酸內切酶切割位點（MultipleCloningSite,即多克隆位點，MCS）（5）具有合適的選擇性標記目前六頁\總數七十四頁\編于八點3、載體的種類（1）質粒（plasmid）載體（又可分為：克隆載體、中間載體、穿梭載體和表達載體）（2）噬菌體（phage）載體

A、λ—噬菌體

B、考斯質粒（粘性質粒）（cosmid)

C、M13—DNA（單鏈絲狀噬菌體）（3）酵母人工染色體載體（YAC）（4）細菌人工染色體載體（BAC）（5）其他載體目前七頁\總數七十四頁\編于八點4、載體的要求獨立復制可插入外源片段易分離，易操作目前八頁\總數七十四頁\編于八點二、質粒（plasmid)1、質粒是存在于細菌細胞質中獨立于染色體而自主復制的共價、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，質粒是一類引人注目的亞細胞有機體，其結構比病毒還要簡單，既無蛋白質外殼，也無細胞外生命周期，只能在寄主細胞內增殖，并隨著寄主細胞的分裂而被遺傳下去。2、它并不是細菌生長所必需的，但可以賦予細菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。質粒類型多種多樣，有F質粒也叫性質粒；有編碼抗菌素抗性基因的質粒叫R質粒，R質?？蓪⑵淇剐赞D移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力；有產生大腸桿菌毒素的Col質粒等。3、質粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定的條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。4、質粒DNA不僅能在細菌中復制，并且在添加真核復制信號和啟動子后，可以構建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。目前九頁\總數七十四頁\編于八點除了酵母的殺傷質粒(Killerplasmid)是RNA質粒外，所有的質粒都是DNA質粒。關于質粒DNA的大小,文獻中有多種說法：小的僅有103KD，僅能編碼2-3種蛋白質；大的可達105KD，兩者相差上百倍。

1Kb～200Kb(Sambroketal.)

5Kb～400Kb(Lehninger)

MD(megadaltons)=106D(兆道爾頓)

1.5Kb≈1MD質粒DNA大小范圍：一般在1-200kb之間,多數10kb左右目前十頁\總數七十四頁\編于八點質粒常見于原核細菌和真菌中目前十一頁\總數七十四頁\編于八點質粒的發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。質粒載體是上世紀70年代實驗室普遍使用的基因克隆載體。

目前十二頁\總數七十四頁\編于八點（一）質粒的生物學特點1、自主復制性(Self-replication)：2、相容性和不相容性(incompatibility)

：3、可轉移性(transferabilityortransitivity)：目前十三頁\總數七十四頁\編于八點1、質粒的自主復制性：質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停?/p>

嚴緊型復制控制的質粒（stringentplasmid）：質粒的復制受寄主細胞染色體DNA和染色體蛋白質的控制，在細胞中以低拷貝數量形式存在，1-3拷貝。（低拷貝數質粒）

松弛型復制控制的質粒（relaxedplasmid）：質粒的復制不受寄主細胞染色體DNA和染色體蛋白質的控制，在細胞中以高拷貝數量形式存在，10-60拷貝。（高拷貝數質粒）

目前十四頁\總數七十四頁\編于八點1、質粒的自主復制性：拷貝數的控制機制–質粒DNA復制啟動控制控制復制起始因子與復制起始位點（ori）的結合P/OrepreporiCopRep抑制蛋白↘起始蛋白↘Pcopcop目前十五頁\總數七十四頁\編于八點質粒復制控制的分子模型：*抑制蛋白質稀釋模型(Inhibitordilutionmodel)關鍵論點是：阻遏蛋白質是組成型合成，其濃度同質粒的拷貝數成正比。*自體阻遏蛋白質模型(Autorepressormodel)關鍵論點是：阻遏蛋白質的合成受負反饋(Negativefeedback)機理調節(jié)，而且其濃度是恒定的。目前十六頁\總數七十四頁\編于八點2、質粒的相容性和不相容性(又稱為親和性與不親和性)

①：在同一時間內從一個細胞中發(fā)現(xiàn)多個不同類型的質粒，只有當不同的質粒是相容的時才能存在于同一個細胞中；②：質粒的不相容性是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一寄主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。不相容的質粒一般都利用同一復制系統(tǒng)，拷貝多的復制更快，結果在細菌繁殖幾代之后，細菌的子細胞中絕大多數都含有占優(yōu)勢的質粒。③：注意：只有當有確切的證據表明第二種B質粒已經進入含有A質粒的寄主細胞，而且它的DNA不受寄主細胞限制體系的降解作用，但這兩種質粒卻不能長期共存，只有在這種情況下，我們才能說A和B是不親和的質粒。④：不親和群的概念：彼此之間互不相容的質粒，屬于同一不親和群(incompatibilitygroup)。彼此能夠共存的質粒則屬于不同的不親和群。同一不親和群的質粒在親緣關系上則比較接近。目前十七頁\總數七十四頁\編于八點⑤質粒不親和性的分子基礎質粒不親和性的分子基礎，主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的：*1負反饋調節(jié)環(huán)(negativefeed-backloop)大多數質粒產生可控制質粒復制的阻遏蛋白質，其數量與細胞中質?？截悢党烧?。在質?？截悢瞪俚那闆r下，細胞中阻遏蛋白質亦相對降低，于是阻遏蛋白質與質粒DNA中靶序列相互作用，使之發(fā)生復制。隨著質粒DNA復制的結果，質?？截悢瞪仙?，于是所編碼產生的阻遏蛋白質也就隨之增多。細胞中阻遏蛋白質濃度增多的結果，會形成二聚體，于是失去與質粒DNA結合并促使其發(fā)生復制的能力。結果質粒復制停止，也就是說質粒拷貝數是受阻遏蛋白質的負反饋調節(jié)：負反饋調節(jié)環(huán)(negativefeed-backloop)當質粒面臨高拷貝數和高濃度的阻遏蛋白時，其復制活動便被抑制了。當質粒處于低拷貝數和低濃度的阻遏蛋白時，其復制活動更會繼續(xù)進行。目前十八頁\總數七十四頁\編于八點*2.同一個細胞含兩種相容質粒

由于這兩種相容質粒親緣關系遠，故它們所產生的阻遏蛋白質就不會互相影響另一個質粒的復制。于是這兩種相容的質粒在同一細胞中都保持著自己的正?？截悢怠?3.同一細胞含兩種不相容的質粒鑒于兩不相容的質粒親緣關系密切，它們所產生的阻遏蛋白質不僅影響自身質粒DNA復制，還會彼此影響對方質粒DNA的復制。這就出現(xiàn)了兩種阻遏蛋白質聯(lián)合調控質粒復制速率?！|粒拷貝數控制體系無法辨別這兩種不相容性質粒，只是隨機地選擇其中一種進行復制。于是出現(xiàn)拷貝數偏差。↓兩種不相容質粒往往拷貝數不相當，其中高拷貝數的質粒對復制抑制劑的敏感性較低拷貝數的要差一些。因此在復制抑制劑(阻遏蛋白質)濃度低的情況下，高拷貝數質粒仍可復制，從而最終使低拷貝質粒被淘汰掉(稀釋掉)。目前十九頁\總數七十四頁\編于八點革蘭氏陰性菌的質?？煞殖蓛纱箢悾?/p>

接合型質粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等；

非接合型質粒：不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用，如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom

和mob基因決定基因工程一般只能利用非接合型質粒，保證分子操作過程中質粒在細胞中的穩(wěn)定性。3、質粒的可轉移性目前二十頁\總數七十四頁\編于八點質粒DNA的分子構型SC構型：即共價閉合環(huán)形的cccDNA所呈現(xiàn)的超螺旋構型。走在凝膠的最前面。OC構型：即開環(huán)DNA(ocDNA)所呈現(xiàn)的構型，其中一條DNA鏈保持完整的環(huán)形結構，另一條鏈上則出現(xiàn)有一個至數個的缺口。走在凝膠的最后方部位。L構型：發(fā)生雙鏈斷裂形成的線性DNA分子所呈現(xiàn)的構型，通稱L型。走在凝膠中間部位。目前二十一頁\總數七十四頁\編于八點目前二十二頁\總數七十四頁\編于八點質粒的電泳圖譜目前二十三頁\總數七十四頁\編于八點（二）質粒載體必須具備的條件

（3種共同的組成部分）1、具有復制區(qū)或復制因子(replicator)

復制因子：

是指一段特定的質粒DNA，它含有質粒DNA的復制起點(ori)(origin

of

replication)，以及編碼質粒DNA和質粒復制所需要的DNA序列結構。*注意復制因子(replicator)和復制子(replicon)之間在概念上的差別。復制子(replicon)：系指含有一個復制起始位點的DNA復制單位，例如細菌染色體、病毒基因組、質?；蚪M等，凡其DNA能夠進行自主復制的遺傳單元均稱為復制子。*在一般的情況下，一個質粒只含有一個復制起點，構成一個獨立的復制子。但在少數的情況下，由融合產生的質粒也會含有兩個復制子，但其中只有一個有活性。目前二十四頁\總數七十四頁\編于八點2、具有抗菌素抗性基因

一種理想的質?？寺≥d體應具有兩種抗菌素抗性基因，以便為寄主細胞提供易于檢測的表型性狀作為選擇記號，而且在有關的限制酶識別位點上插入外源DNA片段之后形成的重組質粒，至少仍要保留一個強選擇記號。3、具有若干限制酶單一識別位點

這樣的分子結構特性，可以滿足基因克隆的需要，而且在其中插入適當大小的外源DNA片段之后，應不影響質粒DNA的復制功能。目前二十五頁\總數七十四頁\編于八點4、具有較小的分子量和較高的拷貝數這類質粒的優(yōu)點在于：

a.低分子量質粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超過15Kb)仍可有效地轉化給受體細胞；

b.含有較高的拷貝數有利于質粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產量；

c.低分子量的質粒分子中對某種限制酶具多重識別位點的機率也就相應下降；目前二十六頁\總數七十四頁\編于八點質粒的遺傳標記基因1、標記基因的作用1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞

這種指示可以是選擇性的（Ampr，Tetr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα），絕大多數為后者。

**有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的—檢測性標記基因。有的基因是不能用作選擇性標記基因（lacZ等）。目前二十七頁\總數七十四頁\編于八點2、

標記基因的種類

1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr

2）生化標記基因

其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ目前二十八頁\總數七十四頁\編于八點3、常用的遺傳標記基因及其作用機制1)四環(huán)素抗性基因（TetrorTcr）

Tetracycline可結合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs的蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr

orApr）

Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異性地切割氨芐青霉素的β—內酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。目前二十九頁\總數七十四頁\編于八點3)氯霉素抗性基因（CmlrorCmr）

Chlorophenicol可結合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素乙?；瘜е乱阴；穆让顾夭荒芙Y合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內。目前三十頁\總數七十四頁\編于八點5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145

AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。

lacZ（lacZα）中含有多克隆位點，當無外源DNA片段插入時，質粒表達β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達的lacZ基因產物（β鏈）互補，產生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因插入后，破壞了lacZα-肽基因的結構，細菌內不能產生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。目前三十一頁\總數七十四頁\編于八點β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產物，檢測直觀b.lacZα編碼的5‘-端可允許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大注：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）

IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）目前三十二頁\總數七十四頁\編于八點

PLacZαLacZβ

轉錄

翻譯

αβLacZ基因的結構與產物pUC18

BamHI片段重組DNA分子

轉化E.coli外源DNA

BamHI片段

涂布在含X-Gal和Amp的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子目前三十三頁\總數七十四頁\編于八點質粒的選擇性標記目前三十四頁\總數七十四頁\編于八點（三）質粒的分類1、根據質?；蚓幋a的特性分五大類：A、致育質粒（fertilityplasmid)/F-質粒：只含有轉移基因（tra-)，除了促進接合轉移外沒有其他功能。B、抗性質粒（resistance

plasmid)/R質粒：含有氯霉素、青霉素或水銀抗性基因。如RP4質粒，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。C、Col質粒（col-plasmid)：編碼大腸桿菌毒素（colicine)，可以殺死其他細菌，如存在于E.coli中的CoE1質粒。目前三十五頁\總數七十四頁\編于八點D、降解質粒（Degradativeplasmids)：可以降解特殊的分子，如：甲苯、水楊酸。E、致瘤質粒（Virulence

plasmids)或叫烈性質粒：可以使宿主細菌變成病原體，如根癌農桿菌的Ti質粒。目前三十六頁\總數七十四頁\編于八點2、人工構建的質粒據功能及用途可分為六大類：A、多拷貝質粒：復制子經過人工突變，除去控制拷貝數的負調節(jié)基因，使質?？截悢颠_到每個細胞數千，用于擴增外源基因。B、測序質粒：C、整合質粒：裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上。D、穿梭質粒：含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制。E、表達質粒：裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內的高效表達。F、探針質粒：篩選克隆或尋找基因元件，通常裝有一個可定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動子、終止子等。目前三十七頁\總數七十四頁\編于八點（四）實驗室常用質粒舉例1、pBR322：該質粒的優(yōu)點：1）分子大小4363bp，比較小、容易純化。2）含有2個抗生素抗性基因,ampR和tetR,可以作為選擇標記。3）受體細胞內，pBR322以多拷貝存在，一般一個細胞內可達到15個，而在蛋白質合成抑制劑存在下，可達到1000-3000拷貝，如氯霉素?？梢援a生大量的重組pBR322分子。目前三十八頁\總數七十四頁\編于八點pBR332質粒目前三十九頁\總數七十四頁\編于八點目前四十頁\總數七十四頁\編于八點目前四十一頁\總數七十四頁\編于八點目前四十二頁\總數七十四頁\編于八點2、pBR325、pBR327：

它們都是在pBR322基礎上去掉1000bp左右的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改變了質粒復制和接合能力。目前四十三頁\總數七十四頁\編于八點目前四十四頁\總數七十四頁\編于八點目前四十五頁\總數七十四頁\編于八點3、pUC質粒：也來自于pBR322，pUC18和pUC19是最常用的質粒載體，幾乎未含多余的DNA片段。優(yōu)點：ColE1復制起點，松弛性，高拷貝，Rop基因（控制拷貝數的基因）突變，松弛性更強。Amp(R)MCS（單一的多種常用內切酶位點）－互補（在MCS中插入外源片段后，可通過—互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒）小分子質粒（小于3000bp)目前四十六頁\總數七十四頁\編于八點拷貝數：500-2000裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’用于基因克隆和測序重要的大腸桿菌質粒載體：pUC18/pUC19目前四十七頁\總數七十四頁\編于八點目前四十八頁\總數七十四頁\編于八點4、pGEM3Z：

pGEM3Z與pUC載體非常相似，不同的是pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識別位點。目前四十九頁\總數七十四頁\編于八點目前五十頁\總數七十四頁\編于八點目前五十一頁\總數七十四頁\編于八點5、多功能質粒載體：pBluescriptKS(±)或SK(±)目前五十二頁\總數七十四頁\編于八點6、植物基因工程常用的幾個載體（煙大）(1)pCAMBIA1391Lenth:10657bp卡那霉素抗性潮霉素抗性gusA目前五十三頁\總數七十四頁\編于八點(2)pCAMBIA1300Lenth:8958bp卡那霉素和潮霉素抗性目前五十四頁\總數七十四頁\編于八點（3）-1在pCAMBIA1300基礎上改造的用于研究兩個蛋白之間相互關系并能通過瞬時表達綠色熒光蛋白的載體目前五十五頁\總數七十四頁\編于八點（3）-2改造的1300載體目前五十六頁\總數七十四頁\編于八點（3）-3改造的1300載體目前五十七頁\總數七十四頁\編于八點（4）用于研究RNAi的載體pFGC1008Length:10914bp目前五十八頁\總數七十四頁\編于八點目前五十九頁\總數七十四頁\編于八點質粒載體的優(yōu)缺點簡便易操作質粒穩(wěn)定質粒文庫不穩(wěn)定質粒容載外源DNA的長度有限質粒文庫放大不均衡目前六十頁\總數七十四頁\編于八點三、細菌噬菌體載體細菌噬菌體簡稱噬菌體，它是專性侵染細菌的病毒。能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉化。高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞，自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增噬菌體結構非常簡單，一般由蛋白質外殼和內部DNA分子組成。兩種主要的噬菌體結構類型是：

1）頭尾結構（λ噬菌體載體）

2）絲狀結構（M13單鏈絲狀噬菌體）。目前六十一頁\總數七十四頁\編于八點（一）λ噬菌體載體

（lambdaphagevector)1、λ噬菌體的生物學特性2、λ噬菌體的感染周期3、λ噬菌體的溶源狀態(tài)目前六十二頁\總數七十四頁\編于八點大腸桿菌的λ噬菌體DNA1、λ噬菌體的生物學特性：λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體，λ

-DNA全長48502個核苷酸，λ

-DNA上至少有61個基因目前六十三頁\總數七十四頁\編于八點5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

粘性末端（COS位點）COScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-

DNA目前六十四頁\總數七十四頁\編于八點2、λ噬菌體感染周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解目前六十五頁\總數七十四頁\編于八點λ噬菌體的侵染循環(huán)目前六十六頁\總數七十四頁\編于八點3、λ噬菌體的溶源狀態(tài)

λ噬菌體感染野生型大腸桿菌后，只有一部分細胞進入裂解循環(huán)。大多數感染的大腸桿菌裂解受挫，λ噬菌體DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不裂解細菌，這種情況稱