基因的克隆與表達(dá)基因克隆(genecloning)基因表達(dá)(geneexpression)-原核基因表達(dá)-真核基因表達(dá)基因克隆GeneCloning一、概述確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的盆子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理提出了中心法則和操縱子學(xué)說，破譯了遺傳密碼1973年Cohen完成第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：

限制性內(nèi)切酶連接酶載體受體細(xì)胞基因克?。ǚ肿涌寺olecularcloning）----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增形成大量子代分子的過程。

基因克隆的技術(shù)路線

目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA二、克隆載體復(fù)制基因(replicator)選擇性記號(hào)克隆位點(diǎn)四、體外重組的策略1、粘末端連接1）全同源粘末端連接最方便簡(jiǎn)單高背景-載體自身環(huán)化雙向插入2）定向克隆：使外源基因定向插入到載體中的克隆策略粘-粘連接：最有效、最快捷粘-平連接：適用于外源基因僅與載體有一個(gè)相同酶切位點(diǎn)，可將另一末端補(bǔ)平2、平末端連接：酶切點(diǎn)為平末端或任何兩個(gè)末端補(bǔ)平的DNA效率低，酶用量大4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個(gè)游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個(gè)A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得1、直接分離3、構(gòu)建cDNA文庫4、PCR5、人工合成6、差異顯示1、直接分離DNA—適用于克隆原核生物的基因組文庫構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）特點(diǎn)及應(yīng)用：包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長(zhǎng)片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況3、構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細(xì)胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。4、PCR擴(kuò)增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法5、人工合成較短的DNA6、差異顯示法(differentialdisplay,DD)—篩選差異表達(dá)的基因基因的表達(dá)GeneExpression一．表達(dá)系統(tǒng)：基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。

據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達(dá)系統(tǒng)：將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。二．原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。

3、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)

4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位

原核生物基因表達(dá)的基本單位（即一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位）。共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達(dá)調(diào)控。包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動(dòng)基因，操作基因)、結(jié)構(gòu)基因5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子終止子

啟動(dòng)子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

一般長(zhǎng)40-60bp，富含A-T堿基對(duì)具有保守序列：-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT-35區(qū)：

RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子，但并不開始轉(zhuǎn)錄各種啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力不同。啟動(dòng)子強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列6、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG

或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長(zhǎng)約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識(shí)別與結(jié)合序列

三．外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解

四．影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素：1、啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。

常見原核強(qiáng)啟動(dòng)子：Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac

:Lac啟動(dòng)子和Trp啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。PL和PR啟動(dòng)子：噬菌體早期左/右向啟動(dòng)子，受λ噬菌體CI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。

2、基因劑量：3、核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD順序與16srRNA3’末端互補(bǔ)程度。AUG—SD間距離。AUG后的核苷酸

五．原核表達(dá)載體：

適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子

SD順序篩選標(biāo)志其它調(diào)控基因

類型：融合型表達(dá)載體：----融合蛋白非融合型表達(dá)載體：---天然完整蛋白分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙

（一）融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點(diǎn)加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA載體部分序列DNA序列位相載體----含有3種讀碼框的系列載體優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定

易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相載體融合型載體----pGEX系列（二）非融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子SD：

ATG：第一個(gè)密碼子非融合型表達(dá)載體----pPL-LamdaPL啟動(dòng)子---溫度誘導(dǎo)插入位點(diǎn)--HpaI（三）分泌型表達(dá)載體：1、主要元件：?jiǎn)?dòng)子和SD序列信號(hào)肽序列：SD下游，編碼信號(hào)肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。

分泌型表達(dá)載體----pINIII-ompA1分泌型融合表達(dá)載體----pEZZ18六．提高表達(dá)水平的手段1、選擇合適載體，提高翻譯水平強(qiáng)啟動(dòng)子----提高轉(zhuǎn)錄水平核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ATG---SD）避免產(chǎn)物降解：分泌/融合表達(dá)細(xì)菌蛋白酶抑制劑2、選擇合適宿主Lac啟動(dòng)子----LacI菌PL/PR--------CI857溶源菌

3、誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)------PLPR/IPTG的化學(xué)誘導(dǎo)----Plac、Ptac

4、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解七．表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：

1、特異性鑒定：熒光抗體法免疫沉淀法免疫印跡法ELISA2、生物學(xué)活性鑒定

八、原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)1、沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識(shí)別、剪除內(nèi)含子2、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對(duì)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)1.

具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2.

具翻譯后修飾系統(tǒng)3.

可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)4.基因治療真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)（一）真核基因組的復(fù)雜性真核基因組龐大，具大量非編碼序列---mRNA豐度不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體---表達(dá)調(diào)控多樣不連續(xù)性：內(nèi)含