紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第1頁紫色達利菊普通介紹紫色達利菊(Petalostemunpurpureum)是一個適應性極強，適口性很好，并廣泛分布于北美草原上一個豆科植物。它能夠給家畜和野生動物提供了優(yōu)良牧草和食物，具高度營養(yǎng)價值。紫色達利菊含有較高縮合單寧并含有極強抗致病性大腸桿菌能力。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第2頁縮合單寧普通介紹植物單寧(VegetableTannin)又稱植物多酚(PlantPolyphenol)，是廣泛存在于植物體內皮、根、葉、花和果實等組織中一類多元酚化合物?？s合單寧一直被認為是飼料抗營養(yǎng)因子，但大量研究發(fā)覺，植物飼料中縮合單寧對反芻動物營養(yǎng)生理含有一定主動作用。飼料中單寧含量過高對動物有很強抗營養(yǎng)作用，但若含適量單寧則能很好地提升動物生產性能紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第3頁縮合單寧普通功效1.對動物生產性能影響

a.縮合單寧能夠提升羊毛產量

b.縮合單寧也對反芻動物繁殖性能有一定影響?？s合單寧能夠增加綿羊排卵數。

c.縮合單寧能夠提升奶牛產奶量

2.對動物健康影響

a.縮合單寧有抗寄生蟲作用紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第4頁一.本試驗研究目標

大腸桿菌作為兼性厭氧菌廣泛存在于哺乳動物胃腸道中，大多數大腸桿菌是共生。但有一些大腸桿菌對人體和動物含有致病性，一些大腸桿菌，如O157:H7，能夠造成出血性結腸炎，甚至造成死亡。而肉牛后腸存在大量致病性大腸桿菌，對環(huán)境和人體健康含有潛在威脅，同時伴隨多年來抗生素廣泛使用，造成大量抗藥性大腸桿菌產生。所以，怎樣有效利用利用自然藥品，如一些植物提取物，抑制大腸桿菌并改進動物機體健康成為研究熱點。在多酚類化合物中，水解單寧和縮合單寧含有獨特生物學活性且個別水解和縮合單寧能夠有效抑制大腸桿菌或其它致病菌。但相對于水解單寧易被吸收而對動物機體造成毒害作用，縮合單寧因為其不被動物機體吸收，所以含有良好應用潛力，尤其是對反芻動物后腸消化道致病性微生物抑制更顯主要。依據報道，紫色達利菊根部所含縮合單寧含有較強抗菌能力，但并無后續(xù)報道，本試驗目標是要經過體內和體外試驗論證這種植物單寧對大腸桿菌抑制作用，并結合電子顯微鏡觀察和細胞膜通透性測定，來簡單闡述縮合單寧對大腸桿菌抑制機理。為未來利用該縮合單寧抑制致病性微生物研究及對不一樣抑菌性縮合單寧篩選提供數據。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第5頁二.研究內容方法：2.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響2.2放牧條件下紫色達利菊縮合單寧對肉牛后腸發(fā)酵及后腸大腸桿菌影響紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第6頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響

3.1.1.2縮合單寧提取

11種植物凍干后，稱取50g粉碎至1mm樣品置于1L含（0.1%AscorbicacidA-7506,Sigma）丙酮，水（70:30v:v）抽提溶液中，黑暗中低溫經組織搗碎機攪拌抽提1h后，將抽提物在3000×g4℃下離心30min，將上清液與等量乙醚（Diethylether,B14993,BDH）混合后靜置5min，分層后棄去上層有機相有機溶液，保留下層液相溶液。重復抽提一次，將兩層液相混合后經旋轉蒸發(fā)儀（35℃120rpm,Laborota4000efficient,Heidolph,Germany）減壓蒸發(fā)掉溶于液相丙酮，再經氮氣吹掃儀（40℃，OA-SYSheatingevaporator24needles,N-EVAPTM112.USA）濃縮凍干。（確定無丙酮，不然無法凍干），凍干樣為植物縮合單寧粗提物（crudeextraction）。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第7頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響

3.1.1.3縮合單寧純化凍干后植物粗提物溶于200ml99%乙醇中，然后與等百分比去離子水混合，互溶后加入交聯(lián)葡聚糖柱（SephadexLH-20）中，攪拌后真空抽濾，重復加入50%乙醇水溶液直到真空抽濾溶液無色為止，棄去濾液，然后加入50%丙酮水溶液，重復沖洗直到濾液變?yōu)闊o色，濾液經旋轉蒸發(fā)儀蒸干后再經氮氣吹掃儀吹干后凍干，此時凍干樣為純縮合單寧，純化后縮合單寧在低溫黑暗中保留（交聯(lián)葡聚糖使用前需浸泡在50%丙酮水溶液中）紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第8頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響

3.1.1.4微生物樣品準備非致病性大腸桿菌（25922;ATCC）和致病性大腸桿菌O157:H7(3081kanR)取自萊斯布里農業(yè)研究中心（Lethbridgeresearchcentreculturecollection.Canada）。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第9頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響

3.1.2試驗設計試驗一，試驗采取單原因試驗設計，將100μl致病性大腸桿菌O157:H7（24h培養(yǎng)液）加入到95ml培養(yǎng)基中，同時加入5ml一定濃度縮合單寧（11種）使終濃度為400μg/ml。試驗二，試驗采取單原因試驗設計，在厭氧條件下，在含100μl大腸桿菌（ATCC25922）培養(yǎng)液中加入定量紫色達利菊縮合單寧使終濃度到達0、25、50、100和200μg/ml,比較紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌影響。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第10頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響

3.1.3試驗條件1.3.1大腸桿菌生長曲線以及微生物數量測定將活化后細菌轉接到經高壓滅菌后M9培養(yǎng)基中((M9MinimalSalts,SigmaChemicalCo.)，同時每升中添加5g水解酪蛋白氨基酸（casaminoacids），0.239gMg2SO4·7H2O，3g過濾滅菌葡萄糖（glucose）和0.011gCaCl2)，37℃培養(yǎng)至對數期，取100μl大腸桿菌和一定濃度11種縮合單寧（溶于M9培養(yǎng)基中）加入到95mlM9培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h。觀察生長曲線。生長曲線利用培養(yǎng)液濃度在紫外分光光度計(UltraSpecPlus4505,Pharmacia,QC,Canada)600nm吸光度折算。不含大腸桿菌培養(yǎng)液調0。同時，將活化后大腸桿菌（ATCC25922）轉接到新鮮滅菌M9培養(yǎng)基中，在厭氧條件下（厭氧操作在厭氧培養(yǎng)箱中進行，VinylAnaerobicChambers,MandelscientificcompanyInc.,Canada），37℃培養(yǎng)至對數期，各取100μl大腸桿菌和250μl不一樣濃度紫色達利菊縮合單寧（溶于M9培養(yǎng)基中）加入到4.65mlM9培養(yǎng)基中，在厭氧條件下，37℃振蕩培養(yǎng)24h，吸光度600測定生長曲線（Genesys20VisibleSpectrophotometer,Thermoscientific）。在5mlM9培養(yǎng)基中縮合單寧濃度分別為0,25,50,100,200μg/ml。24h培養(yǎng)液用PBS梯度稀釋，各取100μl涂布固體LB平板，每個梯度3塊平板，37℃下培養(yǎng)12h后進行菌落計數。試驗重復2次。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第11頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響

3.1.3.2大腸桿菌細胞外膜滲透性測定方法參考LohB（1984）。將活化后大腸桿菌（ATCC25922）在M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長久，10000×g搜集菌體，PBS洗滌兩次后調整至OD600為0.8±0.05。轉移190μl至黑色96孔板中（Costar96-wellblacksolidplates,CostarInc.），加入10μl1mmol/LNPN熒光染色劑（NPN,Cat.no.104043.SigmaChemicalCo.），靜置5min后，加入50μl不一樣濃度紫色達利菊縮合單寧（PBS溶解）至終濃度為0、25、50、100和200μg/ml。利用多功效微孔板檢測系統(tǒng)測定，熒光檢測設置為（excitation360/40,emission460/40）（BioTekSynergyHT,USA）。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第12頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響3.1.3.3細胞表面形態(tài)觀察采取透射電鏡（TEM）和掃描電鏡（SEM）觀察表面形態(tài)。取2.1.3.1中大腸桿菌生長至對數生長久OD600為0.6±0.05時，離心搜集細胞后PBS洗滌兩次后加入固定液固定后觀察。（SEM：HitachiS-570，TEM：HitachiH-500）紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第13頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響3.1.4結論與分析3.1.4.1縮合單寧對大腸桿菌影響紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第14頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響3.1.4.2不一樣植物縮合單寧對致病性大腸桿菌生長曲線影響如表3-1所表示，經過對比11種不一樣類型縮合單寧添加量400μg/ml對致病性大腸桿菌影響發(fā)覺，除紫色達利菊所含縮合單寧對致病性大腸桿菌有顯著抑制外（P<0.01），其它植物縮合單寧對大腸桿菌抑制較小。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第15頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響3.1.4.3紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌細胞膜通透性影響紫色達利菊縮合單寧能夠降低大腸桿菌細胞膜通透性，見圖3-2，伴隨縮合單寧添加量增加，細胞膜通透性隨之降低，200μg/ml顯著降低大腸桿菌ATCC25992細胞膜通透性（P<0.01）。而24h培養(yǎng)基中大腸桿菌數量也伴隨紫色達利菊縮合單寧添加量增加而降低（P<0.01）。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第16頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響3.1.4.3紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌細胞膜通透性影響紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作用機理第17頁3.1紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌體外純培養(yǎng)及對細胞膜通透性影響3.1.4.4縮合單寧對大腸桿菌細胞膜影響如圖3-3所表示，經過掃描電鏡觀察，在厭氧條件下，大腸桿菌生長都受到紫色達利菊縮合單寧抑制，且伴隨單寧含量增加，抑制效果加強。在掃描電鏡圖片A和B中能夠觀察到完整大腸桿菌且細胞外膜清楚無雜物。而伴隨培養(yǎng)基中縮合單寧含量增加，大腸桿菌細胞膜表面會出現絮狀膜外物質。當培養(yǎng)基中縮合單寧到達200μgm-1時，大腸桿菌細胞膜外出現大量絮狀物，且其生長嚴重受阻。而穿透電鏡顯示，縮合單寧含量增加，大腸桿菌細胞膜厚度增加。紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能