實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第1頁(yè)腫瘤轉(zhuǎn)移（TumorMetastasis）是指腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)生長(zhǎng)部位，經(jīng)過(guò)各種路徑轉(zhuǎn)運(yùn)，在機(jī)體內(nèi)遠(yuǎn)離原發(fā)部位器官/組織繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移瘤過(guò)程。大致包含以下步驟：1）原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞大量增殖，新生血管生長(zhǎng)；2）腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，侵襲細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜，進(jìn)而侵入血管、淋巴管或體腔。在這過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌包含基質(zhì)金屬蛋白酶在內(nèi)各種酶類；3）極少數(shù)腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活，形成癌栓，隨血流、淋巴流遷移到另一遠(yuǎn)隔部位或器官；4）腫瘤細(xì)胞與靶器官毛細(xì)血管壁發(fā)生黏附，穿出血管形成微小轉(zhuǎn)移灶，細(xì)胞增殖并產(chǎn)生新血管，形成與原發(fā)腫瘤性質(zhì)一致繼發(fā)瘤，腫瘤細(xì)胞能夠發(fā)生二次侵襲和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第2頁(yè)腫瘤細(xì)胞侵襲移動(dòng)CBAD腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包含三個(gè)主要步驟：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動(dòng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織和血管侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對(duì)人類生命最大威脅。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第3頁(yè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinase，MMPs）是一類依賴金屬離子鋅（Zn2＋)，并以細(xì)胞外基質(zhì)組分作為底物蛋白酶。MMPs家族已分離判別出26個(gè)組員，編號(hào)分別為MMP1～26。依據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為6類，為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、Furin活化MMPs和其它分泌型MMPs。MMPs蛋白由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：1）N端有一段17~29個(gè)殘基，富含疏水氨基酸信號(hào)肽，所以這類蛋白均為分泌蛋白；2）后面是大約80個(gè)氨基酸組成前肽，保守序列PRCGVPNPD中半胱氨酸對(duì)酶原形式維持至關(guān)主要；3）催化結(jié)構(gòu)域由160～170個(gè)殘基組成，含有高度保守序列HEXGHXXGXXH（X表示任意氨基殘基），其中3個(gè)組胺酸與活性中心鋅離子結(jié)合；4）除了MMP-7、MMP-23和MMP-26外，其它MMPsC末端都有一個(gè)類血紅素結(jié)構(gòu)域，參加大分子底物識(shí)別以及與組織金屬蛋白酶抑制劑（TissueInhibitorsofMetalloproteinases，TIMPs）結(jié)合。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第4頁(yè)MMPs蛋白以酶原形式分泌，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)被其它蛋白酶水解分裂而激活。在生理pH值環(huán)境中，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成份，參加細(xì)胞外基質(zhì)重建，調(diào)整細(xì)胞黏著，直接或間接參加胚胎發(fā)育、組織再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理功效。并在各種疾病病理過(guò)程中發(fā)揮作用，如炎癥反應(yīng)、惡性腫瘤浸潤(rùn)、動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管病和多發(fā)性硬化等。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中，較主要有MMP-2與MMP-9等實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第5頁(yè)MMP-2又稱為明膠酶A，其基因位于人類染色體16q21，主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。以相對(duì)分子質(zhì)量為72kDa酶原形式分泌后，N端裂解掉80個(gè)氨基酸成為相對(duì)分子質(zhì)量為66Da或62Da而被激活為活化型MMP-2；MMP-9又稱為明膠酶B，其基因位于染色體20q12-q13，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。以前酶原（相對(duì)分子質(zhì)量為78～82Da）形式合成，后經(jīng)裂解掉19個(gè)氨基酸信號(hào)肽，再糖基化而轉(zhuǎn)變成相對(duì)分子質(zhì)量為95Da酶原形式，酶原降解掉N端73個(gè)氨基酸產(chǎn)生此酶活化形式（相對(duì)分子質(zhì)量為84kDa）。本專題試驗(yàn)中，咱們將用明膠酶譜法檢測(cè)一系列腫瘤患者以及對(duì)照正常人血清中MMP-2與MMP-9活性，以探討其在腫瘤患者血清中表示水平，從而加深同學(xué)們對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第6頁(yè)一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握酶譜法測(cè)定MMP-2與MMP-9活性原理熟悉酶譜法操作技術(shù)了解測(cè)定MMP-2與MMP-9活性意義試驗(yàn)

酶譜法分析食管癌中MMP-2與MMP-9活性實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第7頁(yè)酶譜法是酶活性測(cè)定方法之一。酶活性大小通常由酶降解底物速度與程度決定。酶譜法將酶底物均勻地鋪在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)，先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后創(chuàng)造酶作用適宜環(huán)境，使酶恢復(fù)活性，在凝膠上降解底物。該凝膠經(jīng)過(guò)染色，可展現(xiàn)酶作用痕跡。比較不一樣品該痕跡大小，可知酶活性差異。二、背景與原理實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第8頁(yè)（一）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳

帶電膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶?chǎng)中，向帶相反電荷電極作定向移動(dòng)現(xiàn)象稱為電泳。ν質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度，q質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量，E為電場(chǎng)強(qiáng)度，r為質(zhì)點(diǎn)半徑，η為介質(zhì)粘度。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第9頁(yè)

以聚丙烯酰胺凝膠為支持物電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺在催化劑過(guò)硫酸銨作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。過(guò)硫酸銨催化作用需要TEMED幫助。+催化劑丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰氨凝膠電泳實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第10頁(yè)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶對(duì)pH和溫度改變較穩(wěn)定幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g凝膠孔徑可調(diào)整，依據(jù)被分離物分子量選擇適當(dāng)濃度，經(jīng)過(guò)改變單體及交聯(lián)劑濃度調(diào)整凝膠孔徑分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高分辨率聚丙烯酰胺凝膠特征實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第11頁(yè)聚丙烯酰胺凝膠含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。聚丙烯酰胺凝膠電泳含有分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)在該電泳中保持完整狀態(tài)，依三種原因分開(kāi)：蛋白大小、形狀和電荷。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第12頁(yè)SDS，即十二烷基磺酸鈉SDS含有親脂長(zhǎng)尾和親水性頭（帶負(fù)電）SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)給蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有電荷則被掩蓋了，因而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間本身電荷差異作用假如在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量SDS，則蛋白質(zhì)分子電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小SDS及其作用實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第13頁(yè)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳可用于測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量大小實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第14頁(yè)相對(duì)分子質(zhì)量范圍適宜凝膠濃度(%)蛋

白

質(zhì)10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核

酸(DNA/RNA)10415-20104–1055-10105-2×1062-2.6電泳時(shí)，需要注意凝膠網(wǎng)孔大小對(duì)分析影響。凝膠濃度越大，網(wǎng)孔越小，影響大分子移動(dòng)；凝膠濃度越小網(wǎng)孔越大，對(duì)小分子分子篩效應(yīng)越小。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第15頁(yè)按照緩沖液pH值和凝膠孔徑差異及有沒(méi)有濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：

連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)分離。

不連續(xù)系統(tǒng)中因?yàn)榫彌_液離子成份、pH、凝膠濃度以及電位梯度不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不但有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還含有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清楚度及分辨率均較前者佳。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第16頁(yè)不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成濃縮膠是由AP催化聚合而成大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7Tris-HC1分離膠是由AP催化聚合而成小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液2種孔徑凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成份不連續(xù)性，這是樣品濃縮主要原因不連續(xù)系統(tǒng)特點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第17頁(yè)“快慢離子”理論：

電泳開(kāi)始時(shí)，樣品在濃縮膠pH=6.8，甘氨酸電離較小，甘氨酸根離子帶電最少，移動(dòng)最慢，是“慢離子”。而HCl完全解離成氯離子，氯離子移動(dòng)最快，是“快離子”。蛋白速度居中。

電泳開(kāi)始后，氯離子泳動(dòng)率最大，超出蛋白，所以在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子快速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。進(jìn)入分離膠后，pH=8.8，甘氨酸電離完全，快慢離子層消失。濃縮膠作用是把加入樣品濃縮至一個(gè)狹窄區(qū)帶實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第18頁(yè)MMP-2（明膠酶A）和MMP-9（明膠酶B）底物是明膠。將明膠加到配制聚丙烯酰氨凝膠溶液中，伴隨凝膠形成底物明膠被均勻地鋪在了凝膠內(nèi)含MMP-2與MMP-9樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，MMP-2與MMP-9得已分開(kāi)。但此時(shí)因?yàn)镾DS干擾，MMP-2與MMP-9不能發(fā)揮其酶活性，不能降解底物。用洗滌液去除SDS后，在含二價(jià)金屬離子緩沖溶液中孵育，MMP-2與MMP-9降解凝膠內(nèi)底物明膠。用考馬斯亮藍(lán)染色后，就能看到酶作用痕跡——藍(lán)色背景下“白點(diǎn)”。經(jīng)過(guò)比較該白點(diǎn)大小，可知不一樣品中明膠酶活性大小差異。（二）明膠酶譜法實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第19頁(yè)樣品制備:適量血清、條件培養(yǎng)基濃縮液樣品，肝組織總蛋白提取液樣品直接與5×SDS樣品緩沖液混勻進(jìn)行下一步試驗(yàn)，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋;凝膠制備:玻璃板對(duì)齊后放入夾中垂直卡緊。按下表配10％分離膠，加入TEMED后馬上搖勻即可灌膠，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中氧，促進(jìn)凝膠聚合。膠凝后（異丙醇和膠之間有一條折射線），再等5min使膠充分凝固，倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按下表配4％濃縮膠。將剩下空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子兩邊豎直向上輕輕將其拔出。三、操作步驟實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第20頁(yè)分離膠(10%)濃縮膠(4%)超純水4.5ml3ml30%Acr/Bis2ml0.66mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.25ml10%SDS100μl50μl1%明膠0.5010%Ap100μl25μlTEMED8μl5μl實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第21頁(yè)在每個(gè)加樣孔中加入20μl樣品;電泳：

在4℃100V下，約3h;凝膠處理：電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動(dòng)下洗滌1h，其間換液一次；棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒(méi)過(guò)膠面，至37℃恒溫箱中，24h后取出；棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯亮藍(lán)染液染色約30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍(lán)色背景和白色條帶均十分顯著時(shí)，用5％乙酸中止脫色；待凝膠在5％乙酸中恢復(fù)到適當(dāng)大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以白色條帶凈光密度值相對(duì)定量樣品中酶活性。實(shí)驗(yàn)專題模塊二基質(zhì)金屬明膠酶與腫瘤的關(guān)系第22頁(yè)預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果NNPP135kD92kD72kD