第五章酶分子修飾本章內(nèi)容酶分子修飾的意義化學(xué)修飾物理修飾為什么要進(jìn)行酶分子修飾？酶在生物技術(shù)中占有核心的地位，因?yàn)閹缀跻磺猩矬w內(nèi)的反應(yīng)皆在酶的催化下進(jìn)行的。由于酶具有反應(yīng)專一性、催化效率高及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，故已在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境及能源等方面得到越來越多的應(yīng)用。但總的說來，大規(guī)模應(yīng)用的酶及酶工藝尚不夠多，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是多方面的，但酶本身在應(yīng)用上暴露出來的一些性質(zhì)上的缺點(diǎn)常常是更為根本的原因，這主要表現(xiàn)在下列幾個(gè)方面。（1）穩(wěn)定性差酶是生物活性大分子。一旦離開生物細(xì)胞，離開其本身特定的作用環(huán)境，在發(fā)酵、分離提純、反應(yīng)、制劑及固定化等過程中，常常顯得不夠穩(wěn)定，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。工業(yè)用酶常常由于酶蛋白抗酸、堿和有機(jī)溶劑變性能力差，不耐熱，所以不能適應(yīng)工藝的要求。（2）活性不夠高

酶的活性是與其作用條件有關(guān)的。若工業(yè)反應(yīng)要求的pH和溫度不在酶反應(yīng)的最適pH和最適溫度范圍內(nèi)，此外，底物不溶于水，酶容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制等也限制了酶制劑的應(yīng)用范圍。（3）抗原性酶作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識(shí)別降解。當(dāng)前應(yīng)用的絕大多數(shù)酶皆來自動(dòng)、植物及微生物，對(duì)人體來說這些酶都是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性。若作為醫(yī)藥用酶，注射或口服都可能誘發(fā)相應(yīng)的抗體使酶失活，也可能引起人體的過敏反應(yīng)。這不但影響臨床上的連續(xù)作用，還會(huì)帶來危險(xiǎn)。再則，酶進(jìn)入人體后也常會(huì)由于一些蛋白酶、抑制劑或抗體的作用而失去其活力，特別是當(dāng)酶進(jìn)入體內(nèi)以后不能迅速到達(dá)或集中于病灶時(shí)，這種情況尤為明顯。這些缺點(diǎn)嚴(yán)重影響它的使用效果，甚至無法使用。第五章酶分子修飾由于上述種種原因，人類已經(jīng)不能滿足于僅僅對(duì)天然酶的利用，而希望通過各種方法、按照需要定向地改造酶分子，甚至創(chuàng)造出自然界尚未發(fā)現(xiàn)的新酶，從而適合各行各業(yè)的需要。隨著各個(gè)學(xué)科及生物技術(shù)的發(fā)展，特別是結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究、基因操作技術(shù)及固定化技術(shù)的普及，使酶的改造已開始進(jìn)入了實(shí)用階段。第一節(jié)酶分子修飾的意義提高酶的活力activity

增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性stability

降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty

研究和了解酶分子中主鏈,側(cè)鏈,組成單位,金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響structure一、酶分子修飾的定義

通過各種方法（物理、化學(xué)、蛋白質(zhì)工程）使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改善酶的某些特性和功能的過程。酶的結(jié)構(gòu)決定了酶的性質(zhì)和功能，只要使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，就有可能使酶的某些特性和功能隨著改變。在生物體內(nèi)，酶活性調(diào)節(jié)包括酶原的激活、同工酶調(diào)節(jié)、別構(gòu)調(diào)節(jié)和共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。

無活性的酶的前體稱為酶原。在一定的條件下，酶原水解一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵，致使構(gòu)象發(fā)生改變，表現(xiàn)出酶的活性，稱為酶原的激活。如：胃蛋白酶、胰蛋白酶等。酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某些化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價(jià)結(jié)合，從而改變酶的活性，稱為酶的共價(jià)修飾。在共價(jià)修飾過程中，酶發(fā)生無活性（或低活性）與有活性（或高活性）兩種形式的互變。

二、酶分子修飾方法的分類1、蛋白質(zhì)水平上：通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。化學(xué)修飾和物理修飾2、核酸水平上：蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造酶，利用基因操作技術(shù)對(duì)編碼酶分子的DNA或mRNA進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)(一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu))更為合理的酶蛋白。三、酶分子修飾的歷史1、早期用聚氨基酸修飾蛋白質(zhì)，降低抗原性。2、20世紀(jì)50～60年代用小分子化合物修飾酶分子中氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，主要是酶的活性基團(tuán)，提高酶的活性。3、20世紀(jì)70～80年代用大分子修飾，如用DEAE－右旋糖酐修飾酶，提高酶的穩(wěn)定性。4、20世紀(jì)80年代～現(xiàn)在蛋白質(zhì)工程，在核酸水平上進(jìn)行修飾。第二節(jié)化學(xué)修飾凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使酶蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（側(cè)鏈基團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)等），都可稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。第二節(jié)化學(xué)修飾一、化學(xué)修飾的目標(biāo)二、酶化學(xué)修飾的作用三、酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)四、化學(xué)修飾的方法第二節(jié)化學(xué)修飾化學(xué)修飾可以是共價(jià)修飾，也可以是非共價(jià)修飾；可以是專一性修飾，也可以是非專一性修飾；可以針對(duì)活性中心部位，也可以著眼于活性中心以外的殘基；可以在側(cè)鏈上進(jìn)行，也可以在主鏈上進(jìn)行?；瘜W(xué)修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學(xué)基團(tuán)特性，或直接或經(jīng)過一定的活化過程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造?；瘜W(xué)修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎(chǔ)上，能夠在較大范圍內(nèi)改變酶的性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的優(yōu)良特性，甚至創(chuàng)造出新的活性。一、化學(xué)修飾的目標(biāo)1、通過化學(xué)修飾改造酶的作用特性包括改變酶的活性、作用專一性、對(duì)效應(yīng)物的響應(yīng)性能以及對(duì)輔助因子的要求等。例如，用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，結(jié)果該酶的溶血栓活性提高了100倍。2、通過化學(xué)修飾提高酶的穩(wěn)定性提高酶對(duì)熱、酸、堿和有機(jī)溶劑的耐性等。例如，用戊二醛修飾磷酸化酶，結(jié)果改進(jìn)了該酶在耐熱、抗冷方面的性能。3、通過化學(xué)修飾擴(kuò)大體內(nèi)應(yīng)用可能性防止酶在體內(nèi)可能遇到的非專一性降解，減少和消除免疫原性或抗原性，以利于醫(yī)療應(yīng)用。如：采用水溶性大分子，特別是用PEG進(jìn)行保護(hù)性修飾，使之與免疫系統(tǒng)和蛋白水解系統(tǒng)隔離。超氧化物歧化酶（SOD）、尿酸酶等用PEG修飾后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們?cè)趧?dòng)物血液循環(huán)中被清除的速度，酶的活力可保存15％～45％。二、酶化學(xué)修飾的作用增強(qiáng)酶的天然構(gòu)象的耐熱性與穩(wěn)定性保護(hù)酶的活性部位與提高抗抑制劑的能力維持酶結(jié)構(gòu)功能的完整性，并抗蛋白酶水解。消除酶的抗原性以及穩(wěn)定酶的微環(huán)境通過修飾提高酶活力1、增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。1、增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，其多肽鏈通過一定的方式互相折疊形成了高級(jí)結(jié)構(gòu)即天然構(gòu)象。這種天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與酶分子上許多基團(tuán)間相互作用所產(chǎn)生的能量（焓）和酶分子的無序程度（熵）有關(guān)。酶催化功能的發(fā)揮需要這種高度有序的天然構(gòu)象來保證。如果從熱力學(xué)角度看，酶天然構(gòu)象高度有序，熵值小，應(yīng)該說是不穩(wěn)定的，但是酶分子結(jié)構(gòu)中內(nèi)部基團(tuán)間的相互作用、基團(tuán)與外部水溶液間的相互作用，能產(chǎn)生補(bǔ)償性的焓值和熵值，使整個(gè)酶分子結(jié)構(gòu)的熵值最后處于一種平衡狀態(tài)，緊密有序的構(gòu)象得以維持。當(dāng)酶發(fā)生熱失活時(shí)，雖說是一個(gè)復(fù)雜的過程，但現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為：主要是因?yàn)槊阜肿觾?nèi)基團(tuán)間的相互作用在受熱情況下發(fā)生了變化，原先的平衡力受到了破壞，于是酶分子天然構(gòu)象就向熱力學(xué)上熵值高方向變化，即從緊密有序趨于隨機(jī)松散，折疊結(jié)構(gòu)打開，最終導(dǎo)致了酶催化功能的喪失。酶化學(xué)修飾則是基于上述觀點(diǎn)，從增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性著手來減少酶熱失活。酶化學(xué)修飾通過將酶與修飾劑交聯(lián)后（修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)），就可能使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，并同時(shí)減小酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，從而增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。2、保護(hù)酶活性部位與提高抗抑制劑的能力大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。2、保護(hù)酶活性部位與提高抗抑制劑的能力酶一般是分子量1萬以上的大分子物質(zhì)，而發(fā)揮催化功能的活性部位只是整個(gè)酶分子結(jié)構(gòu)中的一部分。組成活性部位的氨基酸殘基在酶分子的天然構(gòu)象中十分接近，能夠直接與底物結(jié)合，并有利于基團(tuán)間的化學(xué)鍵發(fā)生變化，生成產(chǎn)物。酶活性部位與維持活性部位穩(wěn)定性有關(guān)的基團(tuán)的任何變化都會(huì)影響到酶的催化功能。不管是大分子或小分子抑制劑，它們或者是直接結(jié)合于活性部位來阻斷酶與底物結(jié)合，或者是結(jié)合于酶分子的其它部位后，影響了酶活性部位將底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的反應(yīng)。因此，阻斷抑制劑與酶的結(jié)合是防止酶活性被抑制的關(guān)鍵。酶經(jīng)過化學(xué)修飾共價(jià)交聯(lián)上大分子修飾劑后，大分子修飾劑所產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力就可能有效地阻擋抑制劑對(duì)酶的進(jìn)攻，同時(shí)“遮蓋”保護(hù)酶活性部位，使抑制劑和酶活性部位結(jié)合的難度增加，使酶的抗抑制劑能力增強(qiáng)。3、維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白酶水解酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。3、維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白酶水解酶分子的基本結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)，這一特性就決定了當(dāng)某種酶在作用于底物使之轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的同時(shí)，其本身也可能成為另一種酶（如蛋白水解酶）的底物。對(duì)于蛋白水解酶來講，一般是作用于某些特定敏感鍵后，導(dǎo)致蛋白多肽鏈斷裂。雖然在有些情況下，酶分子被蛋白水解酶水解掉一部分后，并不影響到酶活，在酶原激活時(shí)，甚至還需要這一過程，但更多的是酶在受到蛋白水解酶作用后，由于多肽鏈的斷裂，使酶的功能結(jié)構(gòu)受到了破壞而喪失催化功能。3、維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白酶水解根據(jù)蛋白水解酶是一大分子物質(zhì)，并只是在充分接近多肽鏈上敏感鍵和敏感基團(tuán)后才能產(chǎn)生作用的原理，酶化學(xué)修飾期望交聯(lián)于酶上的大分子修飾劑能產(chǎn)生空間障礙來阻擋蛋白水解酶接近酶分子，能“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。另外，酶分子上許多敏感基團(tuán)（如賴氨酸的ε-氨基等）參與修飾反應(yīng)，交聯(lián)上修飾劑后，也減少了酶分子遭受蛋白水解酶攻擊破壞的可能性。4、消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。4、消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境酶分子結(jié)構(gòu)上除了蛋白水解酶的“切點(diǎn)”外，還有一些氨基酸殘基組成了抗原決定簇，當(dāng)酶作為異源蛋白進(jìn)入機(jī)體后，就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，抗原-抗體反應(yīng)不但能使酶失活，且會(huì)對(duì)人體造成傷害及危險(xiǎn)。但是，通過酶化學(xué)修飾，有些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成了共價(jià)鍵，這樣就可能破壞了酶分子上抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶的抗原性降低乃至消除。同時(shí)，大分子修飾劑也同樣能“遮蓋”抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。4、消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于酶分子表面外形的不規(guī)則、各原子間極性和電荷不同、各氨基酸殘基相互作用等結(jié)果，使酶分子結(jié)構(gòu)的局部形成了一種微環(huán)境（酶活性部位就是處于微環(huán)境中）。這種微環(huán)境可以是極性的，也可以是非極性的，但都直接影響著酶活性部位氨基酸殘基的電離狀態(tài)，為它們發(fā)揮作用提供了合適的條件。酶微環(huán)境的改變會(huì)對(duì)酶催化功能產(chǎn)生直接影響。例如許多酶在極端pH條件下都很快地、不可逆地失活，豬胃酶在pH5時(shí)就失活，雞乳酸脫氫酶在pH4時(shí)就酸性失活，其主要原因就可能是極端pH條件不僅破壞了酶分子上靜電鍵、氫鍵等保持天然構(gòu)象穩(wěn)定的平衡力，同時(shí)也改變了酶分子一些氨基酸殘基的離子化狀態(tài)、它們之間的互相結(jié)合及作用方式，導(dǎo)致了酶微環(huán)境變化。同理，其他有機(jī)溶媒，去垢劑等也由于會(huì)破壞維持酶天然構(gòu)象的平衡力和改變微環(huán)境而導(dǎo)致酶失活。4、消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，除了能減少由于內(nèi)部平衡力被破壞而引起的酶分子伸展打開外，還由于大分子修飾劑本身就是多聚電荷體，所以有可能在酶分子表面形成一層“緩沖外殼”。在一定程度上抵御外界環(huán)境的電荷、極性變化，維持酶活性部位的微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，使酶能在更廣泛的條件下發(fā)揮作用。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明顯。5、通過修飾提高酶活力水溶性大分子與酶分子結(jié)合后，可使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，使酶的活性中心更有利于和底物結(jié)合，并形成準(zhǔn)確的催化部位。三、酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)1、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性活性部位情況活性中心基團(tuán)、輔因子等。穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。2、修飾劑的選擇

修飾劑的分子量及鏈的長度（要求有較大的分子量）修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)）修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件良好的生物相容性和水溶性3、反應(yīng)條件的選擇

修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。酶與修飾劑的分子比例反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。反應(yīng)溫度及時(shí)間嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。反應(yīng)條件隨修飾反應(yīng)的類型不同而不同，需要經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)才能確定。四、化學(xué)修飾的方法1、金屬離子置換修飾；2、大分子結(jié)合修飾；3、肽鏈有限水解修飾；4、酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾；5、氨基酸置換修飾。1、金屬離子置換修飾（1）定義通過改變酶分子所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾。（2）作用范圍金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)

金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶的活性起重要作用。（ａ）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。（ｂ）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。（3）常用金屬離子用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。

Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。（4）方法用氨羧絡(luò)合劑（即含氨基又含羧基）與金屬離子形成螯合型絡(luò)合物除去。EDTA是用得較多的氨羧絡(luò)合劑，但由于其溶解性不好，常用其Na鹽。（ａ）具有一定純度的酶液（含金屬離子M）＋EDTA→EDTA-M+E(暫時(shí)失活）（ｂ）用超濾、透析或分子篩層析等方法將EDTA-M螯合物從酶液中分離，除去M。（ｃ）在酶液中再添加新的金屬離子，使E復(fù)活。例：鋅型蛋白酶（含Zn2＋）與EDTA反應(yīng)生成EDTA-Zn除去，加入Ca2＋（Cacl2）置換成鈣型蛋白酶，使酶活提高20％～30％。酶分子中金屬的取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。例如：?；被崴饷富钚圆课恢械匿\被鈷取代時(shí)，酶的底物專一性和最適pH都有改變，鋅酶對(duì)N－氯－乙酰丙氨酸的最適pH是8.5，而鈷酶的最適pH是7.0，鈷酶對(duì)N－氯乙酰蛋氨酸等三種底物的活力降低。因此，在應(yīng)用上，對(duì)不同的底物可選用鋅酶與鈷酶。天然含鐵超氧化物歧化酶中的鐵原子被錳取代后，酶的穩(wěn)定性和抑制作用發(fā)生顯著改變，重組含錳酶對(duì)H2O2的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，對(duì)NaH3的抑制作用的敏感性顯著降低。2、大分子結(jié)合修飾（1）定義利用水溶性大分子物質(zhì)與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾。大分子結(jié)合修飾品是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。經(jīng)過此法修飾的酶可顯著提高酶活力，增加穩(wěn)定性或降低抗原性。用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍（2）大分子修飾劑的種類ⅰ、糖及其衍生物①右旋糖酐②聚乳糖ⅱ、聚乙二醇聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶

半衰期相對(duì)穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD35h350ⅲ、合成大分子多聚物①PVP（聚N-乙烯吡咯烷酮）②PVA（聚乙烯醇）③PAA（聚丙烯醇）ⅳ、具有生物活性的大分子物質(zhì)①肝素與酶共價(jià)交聯(lián)，在生物體內(nèi)抗原性低，適用于修飾溶解血栓酶類。②血漿蛋白質(zhì)血漿蛋白質(zhì)與酶形成復(fù)合物，在體內(nèi)可被視為自體物質(zhì)（較多用人血清白蛋白），抗原性下降。（3）大分子結(jié)合修飾的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。由于酶的結(jié)構(gòu)各不相同，所以不同的酶所結(jié)合的修飾劑的種類和數(shù)量也有所差別，修飾后酶的特性和功能的改變情況也不一樣。必須通過試驗(yàn)確定最佳的修飾劑的種類和濃度。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。（3）大分子結(jié)合修飾的過程修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。例如：右旋糖酐先經(jīng)高碘酸（HIO4）活化，然后與酶分子的氨基共價(jià)結(jié)合。

（3）大分子結(jié)合修飾的過程修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。（操作時(shí)需控制好修飾劑與酶結(jié)合的條件，以便獲得理想的修飾效果。）（3）大分子結(jié)合修飾的過程分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。測定：修飾后酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、最適溫度、最適pH、半衰期等。e、大分子修飾舉例：例1：用右旋糖酐修飾木瓜蛋白酶1、右旋糖酐的活化（1）右旋糖酐的水溶性好，生物相容性好，可代血漿，分子量適當(dāng)。（2）活化方法：溴化氰法（3）活化的條件：

a、溴化氰：右旋糖酐＝0.5：1；

b、溴化氰分次加入，強(qiáng)烈攪拌；

c、在4℃下進(jìn)行。2、修飾的條件：A、糖：E＝4:1；B、pH9.0；C、4℃進(jìn)行，反應(yīng)4～5h；D、葡聚糖凝膠層析分離。3、結(jié)果比較性質(zhì)天然木瓜蛋白酶（殘存酶活％）修飾后（殘存酶活％）1、耐酸（pH＝2，處理60h）43.3%51.8%2、耐堿（pH＝11，處理60h）58.2%70.0%3、耐熱性（100℃，30min）37.8%52.2%4、抗氧化作用提高5、抗金屬抑制劑提高例2：聚乙二醇修飾枯草桿菌蛋白酶1、聚乙二醇（PEG）的活化（1）聚乙二醇為線性分子，分子量為500～20000，多用750～5000，生物相容性好，在體內(nèi)不殘留，無毒，無抗原性。（2）活化方法：①三氯切嗪法、②迭氮法、③……2、修飾條件：（1）取分子量為5000的PEG，并用①法活化；（2）E:活化PEG=1：4（質(zhì)量比）；（3）pH9.0，室溫作用3小時(shí)，酶活保持87.5%。3、結(jié)果：（1）30℃，pH8.0，該酶的半衰期由1.3h上升到11.7h。（2）60℃，pH8.0，該酶的半衰期由0.07h上升到0.21h。3、肽鏈有限水解修飾（1）定義在不影響酶的活性中心的前提下，利用肽鏈的有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水解修飾。（2）思路

活性中心－－決定催化功能（不能動(dòng)）肽段活性中心之外－－維持空間結(jié)構(gòu)（可以進(jìn)行“修剪”）部分肽鏈水解，有三種可能：（a）活性中心受到破壞，造成酶失活；（b）活性中心完整，基本保持活性，活性可能稍有降低，但同時(shí)抗原性可能大大降低例：木瓜蛋白酶亮氨酸氨肽酶2/3的肽鏈發(fā)生了水解抗原性大大降低（降低80％）

（c）活性中心基本完整，有利于中心與底物結(jié)合，酶活性大大增加。例：天門冬氨酸酶

胰蛋白酶水解

切除十幾個(gè)氨基酸活力提高4～5倍。（3）方法通常使用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑。此外也可其他方法使肽鏈部分水解，達(dá)到修飾目的。例：枯草桿菌中性蛋白酶→用EDTA處理→純水或稀鹽緩沖液透析→該酶部分水解→得到保持蛋白酶活性的小分子肽段，用作消炎劑使用時(shí)，不產(chǎn)生抗原性，治療效果良好。4、酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾（1）定義酶分子側(cè)鏈基團(tuán)就是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能基團(tuán)，如：氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、羥酚基等。這些基團(tuán)可組成各種副鍵，如氫鍵、二硫鍵等，對(duì)于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定性起著重要作用。如果這些功能基團(tuán)發(fā)生改變，就會(huì)引起副鍵的改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而引起酶的特性和功能的改變。使酶分子的側(cè)鏈上的功能基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶的特性，稱為酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾。酶經(jīng)側(cè)鏈基團(tuán)修飾后，對(duì)于酶的活性、穩(wěn)定性或抗原性都會(huì)產(chǎn)生顯著的影響，往往可提高其使用價(jià)值。

水溶性大分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑不溶性小分子側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。

20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。（2）方法針對(duì)不同的基團(tuán)，采用不同的方法（采用不同的修飾劑）。幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)1.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型

1)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。可作用基團(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反應(yīng)

2)酰基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；??？勺饔没鶊F(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）?；磻?yīng)

3)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2－巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。

4)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋

+HI

硝化：

(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1)氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：酰基化與烷基化?；揎梽?

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等

2)羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y定酶分子中羧基的數(shù)目。

+

水溶性碳化二亞胺3)胍基的化學(xué)修飾來源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基酰基化。修飾劑：

丁二酮二羰基化合物1，2－環(huán)己二酮苯乙二醛4)巰基的化學(xué)修飾來源：Cys

修飾反應(yīng):烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）E－SH＋

5)二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）氧化：過甲酸:Performicacid

6)咪唑基的化學(xué)修飾

來源：His

修飾反應(yīng):?；c烷基化酰基化修飾劑:

常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）

++C2H5OH+CO2

烷基化修飾劑：碘乙酸+ICH2COOH+HI7）酚羥基的化學(xué)修飾來源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）8）吲哚基的化學(xué)修飾來源：Trp

修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺

各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法）通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。5、氨基酸置換修飾（1）定義通過肽鏈上某一氨基酸的轉(zhuǎn)換，引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)變化，從而改變酶的某些特性和功能，稱為氨基酸置換修飾。（2）作用提高酶活力或增加酶的穩(wěn)定性。例：

a、酪氨酰－tRNA合成酶若將該酶第51位的蘇氨酸由脯氨酸置換，經(jīng)修飾后，該酶對(duì)ATP的親和性提高近100倍，酶活力提高25倍。

b、T4－溶菌酶若將該酶第3位的異亮氨酸換成半胱氨酸，該半胱氨酸可與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵，其活力保持不變，但該酶對(duì)熱的穩(wěn)定性大大提高。（3）方法a、化學(xué)法例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。b、蛋白質(zhì)工程行之有效的可靠手段。是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，兩者對(duì)酶工程的貢獻(xiàn)有所區(qū)別?；蚬こ讨饕鉀Q的是酶大量生產(chǎn)的問題，而蛋白質(zhì)工程主要是修飾（或改造）天然蛋白質(zhì)，從而獲得具有新的功能的酶或創(chuàng)造全新的酶分子。蛋白質(zhì)工程改造酶是改變或去掉酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸殘基，從而改變酶相關(guān)的功能，使酶在不影響其他功能的前提下表現(xiàn)出某種新的特性。蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造酶目前酶蛋白質(zhì)工程主要是用于工業(yè)用酶的改造。例如，洗衣粉中添加的枯草芽孢桿菌蛋白酶以加強(qiáng)去污能力，但這種酶在漂白劑的作用下易失去活性?，F(xiàn)在利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)將酶蛋白分子中的氨基酸進(jìn)行替代，使酶的抗氧化能力大大提高，因而可與漂白劑同時(shí)使用。利用蛋白質(zhì)工程還可以設(shè)計(jì)新酶。從目前蛋白質(zhì)工程發(fā)展的水平來說，設(shè)計(jì)全新的酶還有一定的困難，但隨著蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)、酶學(xué)等相關(guān)學(xué)科研究的深入，必然會(huì)使蛋白質(zhì)工程發(fā)展剄一個(gè)更高的層次上。第三節(jié)蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程是指用基因操縱技術(shù)高度專一性地改變目標(biāo)蛋白質(zhì)。用此法可得到這樣的蛋白質(zhì)：其結(jié)構(gòu)與母體分子只有1個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的差別。酶蛋白質(zhì)工程的步驟：1、測定目的酶的化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)先測定酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，然后用X射線晶體衍射分析測定其三級(jí)結(jié)構(gòu)。2、新酶結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)根據(jù)目的酶的結(jié)構(gòu)信息選擇突變部位，即選定哪一個(gè)氨基酸殘基要被取代。3．突變基因的獲得根據(jù)欲得到的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，確定其所對(duì)應(yīng)的突變基因上的核苷酸序列。用DNA合成儀合成有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸被置換了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸為引物，通過定位突變技術(shù)，而獲得所需的突變基因，這稱之為寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變，是蛋白質(zhì)工程中最常用的技術(shù)。4．新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生將上述獲得的突變基因插入到合適的基因載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞之中，在適宜的條件下進(jìn)行表達(dá)，就可產(chǎn)生出經(jīng)過氨基酸置換的新蛋白質(zhì)或酶。三維結(jié)構(gòu)新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)藍(lán)圖蛋白質(zhì)突變基因利用產(chǎn)物分子模型DNA突變X－射線晶體衍射克隆和表達(dá)酶蛋白質(zhì)工程的程序圖

蛋白質(zhì)工程是通過周密的分子設(shè)計(jì)把蛋白質(zhì)改造為有預(yù)期的新特征的突變蛋白。在實(shí)際工作中，粗略地說有小改、中改和大改三種做法。小改：指在天然蛋白質(zhì)分子多肽鏈內(nèi)的確定位置上，進(jìn)行一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的改變（置換、刪除或插入）。中改：指對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接。大改：指從頭設(shè)計(jì)一個(gè)全新的自然界不存在的順序。雜交酶雜交酶是指由來自兩種或兩種以上的酶的不同片段構(gòu)建成的新型的酶。首先，利用高度同源的酶進(jìn)行雜交，可以將它們各自的優(yōu)勢進(jìn)行互補(bǔ)，使新獲得的雜交酶的特性介于其親本酶的特性之間。如：利用根瘤土壤桿菌和淡黃色纖維弧菌兩者的B－葡萄糖苷酶進(jìn)行雜交，構(gòu)建出新的雜交B—葡萄糖苷酶，其最佳反應(yīng)條件和對(duì)各種多糖的米氏常數(shù)，都介于兩親本酶之間。其次，通過雜交可以創(chuàng)造具有新催化特性的酶，用它來調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶的專一性或催化活性。迄今為止，幾乎所有的雜交酶都屬于此類酶。創(chuàng)造新雜交酶的方法有多種，如可以利用功能性結(jié)構(gòu)域的交換，以及向合適的蛋白質(zhì)骨架引人底物專一性和催化特性的活性位點(diǎn)等方法。第四節(jié)物理修飾一、定義通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為物理修飾。二、特點(diǎn)不改變酶的組分和基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理方法的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。三、方法壓力、光、電、超聲波。例1：羧肽酶γ經(jīng)高壓處理后，底物特異性發(fā)生改變，合成能力增加，水解能力下降。例2：用高壓處理纖維素酶，最適溫度從50～60℃降低到30～40℃，活性提高10％，從工業(yè)應(yīng)用的角度來看可減少能耗。物理法可預(yù)見性較差。

酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Km沒有明顯變