2/2百駿生物研發(fā)“HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）”做了哪些實驗

2023-04-1014:46近日，山東百駿生物科技有限公司研發(fā)的“HLA-B*1301

基因檢測試劑盒

（PCR-熒光探針法）”獲批上市，下面與您一起了解一下HLA-B*1301

基因檢測試劑盒

（PCR-熒光探針法）在臨床前研發(fā)階段做了哪些實驗。

1、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的主要組成成分產(chǎn)品主要組成成分見下表

2、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的預期用途本產(chǎn)品用于體外定性檢測人外周靜脈全血樣本中HLA-B*1301等位基因，不能區(qū)分HLA-B*1301基因純合型和雜合型。本產(chǎn)品用于計劃服用氨苯砜治療麻風病等疾病患者的用藥指導，以避免氨苯砜綜合征不良反應。氨苯砜綜合征（DHS）是由臨床服用氨苯砜引起的嚴重副作用，屬于重癥藥物不良反應（ADR）的范疇。本病于1949年被首次報道，1951年被Allday和Barnes命名為“D.A.D.P.S.syndrome”（氨苯砜綜5/17合征）。氨苯砜綜合征是一種非劑量依賴性的藥物超敏反應綜合征（DIHS），以突然發(fā)生的丘疹或剝脫性皮疹、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、單核細胞增多以及內(nèi)臟損害等為臨床表現(xiàn)特點。臨床發(fā)病率為0.5-3.6%，死亡率高達10%左右，嚴重威脅患者的生命健康。根據(jù)2013年發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學雜志》期刊的文獻，HLAB*1301作為氨苯砜超敏反應綜合征（DHS）生物學標記物，兩者的相關(guān)性O(shè)R值為20.53，P值為6.84×10?25，具有顯著的統(tǒng)計學意義，證實HLA-B*1301與氨苯砜超敏反應綜合征（DHS）發(fā)生緊密相關(guān)。攜帶HLA-B*1301等位基因單個拷貝的個體（雜合攜帶者），服藥后發(fā)生DHS的風險是不攜帶該等位基因個體的33.6倍；攜帶HLA-B*1301等位基因兩個拷貝的個體（純合攜帶者），服藥后發(fā)生DHS的風險是不攜帶該等位基因個體的100.7倍。2021年，中華醫(yī)學會皮膚性病學分會藥物不良反應研究中心發(fā)表的《Stevens-Johnson綜合征/中毒性表皮壞死松解癥診療專家共識》中提出“HLA?B*1301與氨苯砜、柳氮磺吡啶和復方磺胺甲噁唑誘發(fā)的藥物超敏反應綜合征及SJS/TEN相關(guān)”，治療前檢測風險HLA基因可預防SJS/TEN等重癥藥物不良反應。本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者個體化治療的選擇應結(jié)合其癥狀/體征、病史、其它實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮，不能以本試劑盒檢測結(jié)果作為臨床是否用藥的唯一依據(jù)。

3、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的檢驗原理本試劑盒采用實時熒光定量PCR方法結(jié)合水解探針技術(shù)，對HLA-B*1301等位基因的兩個特定區(qū)域進行特異性擴增，通過擴增曲線和Ct值來判斷該個體是否攜帶HLA-B*1301等位基因。

4、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的主要原材料研究4.1主要原材料的選擇主要原材料包括：引物、探針、Taq酶、dNTP和陰陽性對照品等，原材料均通過外購的方式獲得。其中引物和探針為開發(fā)人自行設(shè)計，由合成公司采用DNA合成儀合成，經(jīng)純化后獲得。通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應商，制定了各主要原材料質(zhì)量標準并經(jīng)檢驗合格。4.2企業(yè)參考品設(shè)置開發(fā)人設(shè)計了完整的企業(yè)參考品（RM（P001）），包括企業(yè)準確度參考品、企業(yè)特異性參考品、企業(yè)檢出限參考品、企業(yè)精密度參考品。參考品采用臨床樣本制備而成。組成如下：(1)陽性參考品10份，命名為企業(yè)準確度參考品（P01~P10）。來源于經(jīng)檢測為HLA-B*1301純合型陽性及HLA-B*1301雜合型陽性的樣本。(2)陰性參考品10份，命名為企業(yè)特異性參考品（N01~N10）。來源于經(jīng)檢測為HLA-B*1301陰性的樣本。(3)精密度參考品2份，命名為企業(yè)精密度參考品（PC01~PC02）。為使用HLA-B*1301陰性的樣本作為基質(zhì)，將HLA-B*1301雜合型陽性樣本稀釋至指定濃度后獲得。(4)檢出限參考品1份，命名為企業(yè)檢出限參考品LD01。為使用HLA-7/17B*1301陰性的樣本作為基質(zhì)，將HLA-B*1301雜合型陽性樣本稀釋至指定濃度后獲得。

5、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的生產(chǎn)工藝和反應體系研究開發(fā)人對試劑盒反應體系的研究包括靶標序列的選擇、引物探針濃度的確定、Taq酶濃度的確定、dNTPMix濃度的確定、鎂離子濃度的確定、陰/陽性對照品配方的確定等。對反應條件的研究包括PCR退火溫度、擴增循環(huán)數(shù)、擴增反應時間、PCR反應體積等。通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。開發(fā)人根據(jù)試劑盒中試劑及組分的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。

6、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的分析性能評估該產(chǎn)品分析性能包括最低檢出限、精密度、準確度、分析特異性（交叉反應、干擾試驗）、核酸提取純化性能等。開發(fā)人開展了有效運行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的3批產(chǎn)品在適用機型上的性能評估。在最低檢出限研究中，開發(fā)人對將HLA-B*1301雜合基因稀釋至指定濃度的樣本進行20次重復檢測，將至少18次檢測結(jié)果CT值≤30且擴增曲線為指數(shù)擴增曲線的濃度作為P1、P2反應體系的各自最低檢出限。另采用3批試劑進行檢出限的驗證，符合檢出限的性能要求，即最低檢出限為5ng/μL。在準確度研究中，開發(fā)人選取了120例測序結(jié)果為HLA-B*1301陽性的樣本（其中7例純合型），采用3批試劑按說明書要求進行檢測，結(jié)果顯示陽性符合率100%。在精密度研究中，開發(fā)人針對HLA-B*1301陰性，HLA-B*1301弱陽性和HLA-B*1301中/強陽性三個水平的臨床樣本進行了精密度評8/17價。分別評價了本產(chǎn)品的室內(nèi)和室間精密度，試驗包含不同地點、操作者、儀器、運行、批次等影響因素，結(jié)果顯示CT值CV值均符合性能要求。分析特異性實驗涵蓋交叉反應研究及干擾因素研究。交叉反應評價中，開發(fā)人采用了自然人群中HLA-B區(qū)域攜帶頻率大于4%的15種同源性序列進行了交叉反應研究，經(jīng)驗證，所選擇15種同源序列樣本與本產(chǎn)品均不產(chǎn)生交叉反應。干擾研究實驗中，咖啡采用在中低濃度的HLA-B*1301陽性及陰性樣本中加入干擾物質(zhì)的方法進行驗證，干擾實驗結(jié)果顯示，樣本中內(nèi)源性及藥源性干擾物質(zhì)不大于以下濃度時，試劑盒各項檢測結(jié)果符合要求：血紅素300g/L、甘油三酯6mmol/L、膽紅素25μmol/L、西替利嗪500μg/L、潑尼松90μg/L、克拉霉素5μg/mL、伊曲康唑4μg/mL、阿維A1000ng/mL、甲氨蝶呤30μmol/L、氨苯砜4.82mg/L。針對核酸提取純化步驟，開發(fā)人將試劑盒配套使用的核酸提取試劑與已上市質(zhì)量較好的提取試劑對全血樣本的DNA提取效率進行平行比對，結(jié)果顯示核酸提取效率相當，并對配套使用的核酸提取試劑提取后DNA的純度、濃度，精密度和抗干擾能力進行了評估，性能均可滿足試劑盒檢驗要求。

7、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的陽性判斷值的確定使用ROC曲線法，采用HLA-B*1301雜合、純合陽性及陰性全血樣本共計260例，利用考核試劑P1及P2反應體系的檢測結(jié)果與樣本測序結(jié)果進行一致性比對分析。通過ROC曲線計算，最終確定檢測基因片段P1及P2的陽性判斷值，均為Ct值≤30。同時通過對上述260例樣本的內(nèi)參基因檢測結(jié)果進行置信區(qū)間分9/17析，最終確定了內(nèi)參基因檢測結(jié)果的合格標準為Ct≤30。

8、HLA-B*1301基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）的穩(wěn)定性研究開發(fā)人對本產(chǎn)品的貨架效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、樣本穩(wěn)定性進行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時間。貨架效期穩(wěn)定性：采用3批試劑進行研究，將試劑盒保存在-20±5℃條件下，分別于保存第0月、第3月、第6月、第9月、第11月、第12月、第13月和第14月時取出試劑盒，對試劑盒的分析特異性、檢出限、測量準確度、測量精密度四項性能指標進行檢測，確定產(chǎn)品在規(guī)定的儲存條件下，可穩(wěn)定保存12個月。開瓶穩(wěn)定性：將試劑盒于室溫下開瓶解凍后，再置于-20±5℃冷凍條件下冷凍保存，參考實驗室日常檢測條件下使用頻次及使用方式，分別設(shè)置開瓶后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天分別對準確度、分析特異性、測量精密度、檢出限指標進行評估，試劑盒在開瓶凍融后短期（7天內(nèi)）各性能均符合產(chǎn)品技術(shù)要求。同時，開發(fā)人使用開瓶復融試劑完成長期（7個月）穩(wěn)定性研究，各性能均符合產(chǎn)品技術(shù)要求。最終開瓶穩(wěn)定性結(jié)論為：在不同使用頻次下，試劑盒性能均滿足要求，確定試劑盒開瓶凍融穩(wěn)定性有效期為6個月。凍融穩(wěn)定性：試劑盒置于-20±5℃冷凍條件下冷凍保存，期間分次取出，室溫放置至試劑盒內(nèi)組分完全融化后再重新放置于-20±5℃冷凍條件下冷凍保存。分別在凍融第1次，第2次，第3次，第4次、第5次、第6次、第7次設(shè)取樣檢測時間點。對于不同凍融次數(shù)的試劑盒分別評價分析特異性、檢出限