備案號(hào)：53101-2017分類號(hào)案卷號(hào)件號(hào)I1選取發(fā)病香蕉種苗組織，切成小塊(3×3mm),將小塊組織先放于70%乙醇(酒精)溶液中浸2基上培養(yǎng)產(chǎn)生孢子，并制成孢子懸浮液保存于30%～40%甘油中，置于-20°C冰箱保存至少6個(gè)月；36(資料性附錄)香蕉枯萎病病原及癥狀A(yù).1癥狀A(yù).1.1外部癥狀香蕉枯萎病是一種典型的維管束病害，香蕉種苗感病早期無(wú)明顯外部癥狀，染病一段時(shí)間后，病害先從下部葉片開(kāi)始呈現(xiàn)癥狀。發(fā)病初期葉片褪綠、無(wú)光澤，呈黃綠色，后期葉片局部甚至整葉黃化嚴(yán)重時(shí)部分根變褐腐爛(圖1A)。A.1.2內(nèi)部癥狀發(fā)病初期，剖開(kāi)香蕉種苗球莖基部，可見(jiàn)紅褐色至褐色的壞死斑點(diǎn)，沿著褐色病斑縱剖香蕉種苗的球莖，可見(jiàn)紅褐色至褐色成線條狀病變的維管束，近莖基部顏色深，病變一直延伸到假莖部。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，褐色病斑擴(kuò)大至整個(gè)球莖部，根系變褐腐爛(圖1B)圖1香蕉種苗枯萎病癥狀A(yù).2病原香蕉枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.cubense(E.FSmSnyderHansenFOC發(fā)現(xiàn)有3個(gè)生理小種，1號(hào)生理小種(FOC1)可感染粉蕉(ABB,PisangAwak),香蕉的栽培種"大蜜啥”(AAA,GrosMichel)和龍牙蕉(AAB,Silk);2號(hào)生理小種(FOC2)為害三倍體雜種棱指蕉(AAB,Bluggoe),但不侵染"大蜜啥",該生理小種呈區(qū)域性分布；4號(hào)生理小種(FOC4)是1967年首先在我國(guó)臺(tái)灣報(bào)道的一個(gè)生理小種，除了可感染粉蕉外，還能侵染“大蜜啥”、矮香蕉(AAA,DrawfCanvendish)、野生蕉(BB,Musabalbisiana)和棱指蕉等幾乎所有的香蕉品種及對(duì)其他生理小種有抗性的香牙蕉(AAA,Cavendish),因此其危險(xiǎn)性和毀滅性最大，該生理小種在我國(guó)大部分的香蕉產(chǎn)區(qū)已有發(fā)生和報(bào)道；此外，原來(lái)的3號(hào)生理小種因只為害野生觀賞性羯尾蕉屬(Heliconiaspp.)植物，而對(duì)香蕉栽培品種不造成危害，故已經(jīng)被排除在香蕉枯萎病菌之外。香蕉枯萎病菌只有無(wú)性型，可產(chǎn)生3種形態(tài)的無(wú)性分生孢子，大孢子、小孢子和厚垣孢子。大孢子有明顯的足細(xì)胞，鐮刀形，具3個(gè)～5個(gè)隔膜，壁薄，(22~36)μm×(4~5)μm;小孢子圓形或橢圓形至腎形，具0個(gè)~1個(gè)隔膜，壁薄，(5~7)μm×(2.5~3)μm,在人工培養(yǎng)基上很容易產(chǎn)生和觀察到。厚垣孢子圓形，壁厚，間生或頂生于菌絲上，多單生，9μm×7μm(圖2)。458種苗生產(chǎn)/經(jīng)營(yíng)者：調(diào)查地點(diǎn)：調(diào)查面積(m2)/貨物數(shù)量(株):調(diào)查日期：種苗品種：種苗類型：種苗來(lái)源：樣品編號(hào)：癥狀描述：發(fā)病率及分布情況：初步判斷：送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)樣品采集及編號(hào)：調(diào)查單位(蓋章):填表人(簽名):注：本表一式兩聯(lián)，第一聯(lián)抽樣單位存檔，第二聯(lián)交受檢單位。67(送檢單位)地址及郵編調(diào)查日期采樣地點(diǎn)樣品種苗品種(根、球莖、假莖等)調(diào)查數(shù)量或面積發(fā)病率及分布情況：抽樣方法和抽樣比例：抽樣單位(蓋章):填表人(簽名):生產(chǎn)單位/經(jīng)營(yíng)者(蓋章):現(xiàn)場(chǎng)負(fù)責(zé)人(簽名):注：本表一式兩聯(lián)，第一聯(lián)抽樣單位存檔，第二聯(lián)交送檢/受檢單位。8(規(guī)范性附錄)PCR及凝膠電泳檢測(cè)以SDS法抽提香蕉枯萎病菌的DNA;以CTAB法抽提發(fā)病香蕉種苗病組織的DNA。抽提所得DNA均用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度，以O(shè)D2so/OD2so的比值為1.8~2.0時(shí)最佳，如果未達(dá)到要求，以酚氯仿再次抽提DNA,直至達(dá)到要求。調(diào)整DNA的濃度為10~50ngμL'為宜；然后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。D.2引物序列D.2.11號(hào)生理小種的特異性引物D.2.24號(hào)生理小種的特異性引物D.2.3尖鐮孢菌的通用引物模板DNA1μL(相當(dāng)于10-20ngDNA),10×PCR緩沖液(含Mg2)2.5μL,2.5mmolL'dNTP2μL,95℃預(yù)變性2min;94℃變性40sec,54℃退火40sec,72℃延伸1min,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸D.4瓊脂糖凝膠電泳制備1%的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNAMarker作為分子量標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析并拍照記錄電泳結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，4號(hào)生理小種特異性引物、1號(hào)生理小種特異性引物以及尖鐮孢通用引物均能分別擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，大小分別為593bp、354bp、729bp;表明所篩選出的特異性引物能夠分別鑒定香蕉枯萎病菌的生理小種，同時(shí)因?yàn)橛屑忡犳咄ㄓ靡锏臋z測(cè)結(jié)果，可以避免沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。2345678910111213141516171000bp750bp500bp250bp100bp750bp500bp250bp100bp1000bp750bp500bp產(chǎn)物電泳圖：C,尖鐮孢通用引物PCR產(chǎn)物電泳圖。1-7為香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種菌株：8-13為香蕉枯萎病菌1號(hào)生理小種菌株；14-20為尖鐮孢菌其他專化型菌株；21為半裸鐮孢；20為立枯絲核菌；23為陰性對(duì)照(清水)。(規(guī)范性附錄)(送檢單位)地址及郵編調(diào)查日期采樣地點(diǎn)檢測(cè)鑒定方法：檢測(cè)鑒定結(jié)果：鑒