PAGE分子生物學(xué)大實驗—目的基因的克隆與及表達第一節(jié)基因操作概述 2一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 2二、質(zhì)粒概述 4三、凝膠電泳 5四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 6五、重組質(zhì)粒的連接 7六、限制性內(nèi)切酶消化 7七、SDS蛋白質(zhì)電泳 7第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑 7一、材料 8二、設(shè)備 8三、試劑： 9第三節(jié)操作步驟 10一、目的基因的獲得： 10二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）載體的獲得： 11三、pET-21b等與目的片段的連接作用 12四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行陽性克隆子篩選與鑒定 13五、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21plyst，搖菌進行SDS電泳。 14六、融合蛋白的毒力測定 16第四節(jié)本實驗的實驗報告 16

第一節(jié)基因操作概述一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。它包括三個基本步驟：(1)變性(Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；(2)退火(Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；(3)延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成。由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25～35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106倍。

（一）、PCR反應(yīng)中的主要成份

1、引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1)引物長度約為16～30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。(2)引物中G+C含量通常為40%～60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(4)引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。(7)引物5'端對擴增特異性影響不大，可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1～2個保護堿基。(8)引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2～1.0μmoL/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。

2、4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計測定其準(zhǔn)確濃度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20～200μmol/L。3、Mg2+：Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5～2mmol/L。對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1～5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進行預(yù)備實驗，選出最適的Mg2+濃度。4、模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進行擴增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102～105個拷貝，對于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。擴增多拷貝序列時，用量更少。靈敏的PCR可從一個細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。

5、TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般PCR中出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)。在100μlPCR反應(yīng)中，1.5～2單位的TaqDNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。

6、反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10～50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+。Tris·Cl在20℃時pH為8.3～8.8，但在實際PCR反應(yīng)中，pH為6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性。

（二）、PCR反應(yīng)參數(shù)

1、變性：在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時間為94℃1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達到適當(dāng)?shù)臏囟取?/p>

2、退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高，長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。通常退火溫度和時間為37℃～55℃，1～2min。

3、延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃～85℃。延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。

4、循環(huán)次數(shù)：當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25～30輪循環(huán)擴增后，反應(yīng)中TaqDNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時產(chǎn)物量仍不夠，需要進一步擴增。二、質(zhì)粒概述把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進受體細(xì)胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。

質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1～200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA，簡稱ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。三、凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide，EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1～10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。

瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。目前，一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：

1、DNA的分子大?。?/p>

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2～1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3～0.7%，DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8～1.0%。

3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，開環(huán)DNA移動最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

4、電源電壓

在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。

轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl2，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。進入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15％的無菌甘油于～70℃保存(半年)，因此CaCl2法為使用更廣泛。

為了提高轉(zhuǎn)化效率，實驗中要考慮以下幾個重要因素：

1、細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。

2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。

3、試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2等均需是最高純度的(GR或AR)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。

4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。五、重組質(zhì)粒的連接

外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：

1、帶有非互補突出端的片段用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都可能有。

3、帶有平末端是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。六、限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的DNA序列位點上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識別長度為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱的特異序列，切割位點相對于二重對稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對稱軸處同時切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段，另一些酶則在對稱軸兩側(cè)相對的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即粘端）的DNA片段。1個單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50μl體積1小時內(nèi)完全切開1μgλ噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件，甚至對同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對其生產(chǎn)的酶制劑優(yōu)化過反應(yīng)條件，因此購買的內(nèi)切酶說明書上均有其識別序列和切割位點，同時提供有酶切緩沖液（buffer，10×、5×）和最適條件，使得酶切反應(yīng)變得日益簡單。七、SDS蛋白質(zhì)電泳細(xì)菌體中含有大量蛋白質(zhì)，具有不同的電荷和分子量。強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過加熱使蛋白質(zhì)解離，大量的SDS結(jié)合蛋白質(zhì)，使其帶相同密度的負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預(yù)計表達蛋白的分子量，可篩選陽性表達的重組體。第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑一、材料

不同來源的模板DNA；E.coliDH5α菌株：Rˉ，Mˉ，Ampˉ；E.coliBL21Plyst（DE3）FˉompThsdSB(rBˉmBˉ)galdcm(DE3)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：購自BeijingTianweiCorporation。本實驗所用的特異引物：表2-1設(shè)計Cry1Ac結(jié)構(gòu)域基因特異引物引物序號引物序列15'-CGCGGATCCGGGTGGAGAAAGAATA-3'25'-CGCGTCGACATGTCGATGGGAAGTG-3'35'-CGCGGATCCGGATTGGGTAAGGTAT-3'455'-CGCGGATCCGGTTCGTGTACGGTATG-3'65'-CGCGTCGACTTAGCCCTAGTTGGT-3'7895'-CGCGTCGACTATACCTTACCCAATCTC-3'表2-2Cry1Ac結(jié)構(gòu)域菌體陽性克隆子的引物引物名稱引物序列T75'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'SP65'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'注：Tm=4（C+G）+2（A+T）二、設(shè)備

PCR小管；離心管；DNA擴增儀(PE公司或eppendorf)；瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)；臺式高速離心機；恒溫振蕩搖床；高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)；渦旋振蕩器；恒溫水浴鍋；臺式高速離心機；微波爐或電爐；紫外透射儀；數(shù)碼相機及其附件；電熱恒溫培養(yǎng)箱；無菌工作臺；低溫冰箱；制冰機；分光光度計；微量移液槍(20μl，200μl，1000μl)及吸頭；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；蛋白電泳系統(tǒng)ProteawIIBio-Rad；超聲波破碎儀；Millipore純水儀；空氣浴振蕩器；電子天平。三、試劑：1、限制性內(nèi)切酶(BamHI，SalI，NdeI)2、10×PCR反應(yīng)緩沖液

3、MgCl2：25mmol/L

4、4種dNTP混合物

5、TaqDNA聚合酶

6、異丙醇7、LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

8、LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加13g瓊脂粉，高壓滅菌。

9、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl(pH8。0)溶液配制成10mg/ml，并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

11、50×TAE（Tris-乙酸）：Tris堿24.2g、冰乙酸5.71mL、5mol/LEDTA(PH8.0)10mL加去離子水定容至100mL，使用時用去離子水作50倍稀釋，即為工作液。

12、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。

13、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1％SDS。

14、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。

15、RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7。5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20℃。

16、飽和酚：市售酚17、按體積/體積＝1：1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1：1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套。

18、TE緩沖液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。

19、電泳所用試劑：上樣緩沖液(6×)：0.25%溴酚藍，40%(w/v)蔗糖水溶液。20、溴化乙錠(EB)溶液母液：將EB配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。21、1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml0.5×TAE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TAE），即可上樣。22、含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右，加入Amp儲存液，使終濃度為50ug/ml，搖勻后鋪板。23、連接反應(yīng)緩沖液(10×)：0.5mol/LTris·Cl(pH7.6)，100mol/LMgCl2，100mol/L二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml牛血清清蛋白(組分V.Sigma產(chǎn)品）（可用可不用），10mol/LATP（過濾滅菌）。

24、T4DNA連接酶(T4DNAligase)；購買成品。

25、IPTG儲液(200mg/ml)：在800μl蒸餾水中溶解200mgIPTG后，用蒸餾水定容至1ml，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。26、30%儲備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亞甲雙丙烯酰胺（Bis）1.0g，混勻后加ddH2O，37OC溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室溫。

27、1.5MTris-HCl(pH8.0)：Tris18.17g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)pH至8.0，定容至100ml。

28、1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至100ml。

29、10%SDS：電泳級SDS10.0g加ddH2O68℃助溶，濃鹽酸調(diào)至pH72，定容至100ml。

30、10′電泳緩沖液(pH8.3)：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解，定容至100ml。

31、10%過硫酸銨（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。

32、2′SDS電泳上樣緩沖液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml，b-巰基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚蘭1.0ml，ddH2O3.5ml。

33、考馬斯亮蘭染色液：考馬斯亮蘭0.5g，甲醇200ml，冰醋酸50ml，ddH2O250ml。

34、脫色液：甲醇50ml，冰醋酸50ml，ddH2O400ml。35、0.05mol/LCaCl2溶液：稱取0.28gCaCl2(無水，分析純)，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌。第三節(jié)操作步驟一、目的基因的獲得：（一）、建立PCR操作程序PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序Cry1Ac基因模板2μL正向引物2μL反向引物2μL10×Buffer5μLdNTP4μLTaqDNA聚合酶1μL去離子水34μL總體積50μLStep194℃3minStep294℃1minStep360℃1minStep472℃2minStep5Gotostep230cyclesStep672℃10min（二）、進行瓊脂糖凝膠電泳并且作柱回收DNA回收試劑盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）1、用干凈的刀片將單一的DNA條帶從瓊脂糖凝膠上切下，盡量切除多余凝膠。2、加入溶膠液500μL，50℃水浴放置10min。3、將上一步所的溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液。4、加700μL漂洗液，12000r/min離心30s，棄掉廢液。5、加500μL漂洗液，12000r/min離心30s，棄掉廢液。6、將離心吸附柱放回收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。7、再將離心柱放在30～40℃溫箱中烘干10min。8、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，在吸附膜中間位置加入40μL洗脫緩沖液，室溫放置2min，12000r/min離心1min。注意事項

紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。（三）、進行目的片段的雙酶切：結(jié)構(gòu)域基因的雙酶切反應(yīng)體系組分組分目的片段模板DNA10μL限制性內(nèi)切酶BamHI2μL；SalI2μL緩沖液Tbuffer3μL去離子水3μL總體積20μL在此條件下，37℃反應(yīng)1h。接下來作柱回收。二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）載體的獲得：（一）、取菌37℃過夜搖菌提取質(zhì)粒。1、取1.2mL培養(yǎng)物倒入離心管中，4℃8000r/min離心1min，重復(fù)一次。2、吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。3、加入100uL預(yù)冷的溶液Ⅰ，在渦旋混合器上劇烈振蕩直至看不見沉淀。4、加入200uL新配制的溶液Ⅱ，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物，不要振蕩，室溫3～5min。5、加入150uL預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和地振蕩混勻，可見白色絮狀沉淀，然后放冰上5～10min。6、加入400uL飽和酚：氯仿（1：1）進行抽提，以除去蛋白質(zhì)。12000r/min離心5min。7、上清液加入等體積的異丙醇沉淀，-20℃放置10～30min。15000r/min離心3min。去上清得到質(zhì)粒DNA沉淀。8、沉淀用200uL預(yù)冷70%的乙醇沖洗沉淀。9、用一小條濾紙小心吸去管壁殘留的上清，將離心管放在超凈臺中通風(fēng)干燥，直至無乙醇?xì)馕丁?0、加入適當(dāng)濃度Rnase的TE緩沖液（或去離子水）重溶質(zhì)粒DNA，振蕩混勻，-20℃?zhèn)溆?。（二）進行高效表達載體的雙酶切：載體的雙酶切反應(yīng)體系表達載體10μL限制性內(nèi)切酶BamHI2μL；SalI2μL緩沖液Tbuffer3μL去離子水3μL總體積20μL在此條件下，37℃反應(yīng)1h。接下來作柱回收。三、pET-21b等與目的片段的連接作用1、在離心管中建立下列連接體系10×T4DNALigaseBuffer2。5μL目的片段10μL表達載體2μLT4DNALigase1μLdH2Oupto25μL2、16℃過夜反應(yīng)。四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進行陽性克隆子篩選與鑒定（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備（DH5α、BL21plyst）注：常規(guī)CaCl2法，要求無菌操作。1、從37℃培養(yǎng)的16～20h的新鮮平板中挑取一個DH5單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基中，37℃，180r/min震蕩過夜。按1%的接種于小三角瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)3h至OD600為0.5。3、4000r/min離心5min，收集菌體，倒去上清，加入1/2體積預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2輕輕懸浮沉淀，置冰上30min。4、4000r/min離心5min，倒去上清，加入1/10體積預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2輕輕懸浮沉淀。5、進行分裝，向每一個離心管中加約200uL的感受態(tài)細(xì)胞。4℃保存?zhèn)溆茫ㄒ恍瞧谟猛辏＃ǘ┻B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化1、5uL～10uL連接產(chǎn)物和200uL感受態(tài)細(xì)胞在無菌條件下混勻2、冰浴30min3、42℃熱擊，1.5min。4、冰浴2min5、加入500uL～800uLLB液體培養(yǎng)基（無菌條件下）。6、37℃擴培，180r/min進行60min。7、取100uL～200uL涂含有氨芐抗性的LB平板。8、放在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。（三）從平板中調(diào)取30個菌落編號1～30，經(jīng)T7、SP6特異引物進行PCR擴增，來篩選陽性克隆子，最后只需選擇一個陽性重組質(zhì)粒，分別進行單酶切、雙酶切及及原始目的片段PCR擴增以確保目的片段真正地連接到表達載體上。Cry1Ac結(jié)構(gòu)域菌體陽性克隆子的PCR擴增建立以下體系每PCR管分裝500μL/30=16μL。PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序Cry1Ac菌體模板少量SP6引物20μLT7引物20μL10×Buffer50μLdNTP（10mmol/L）10uLTaqDNA聚合酶5μL去離子水400μL總體積500μLStep194℃5minStep294℃1minStep352℃1minStep472℃2minStep5Gotostep230cyclesStep672℃10min當(dāng)載體上T7、SP6特異引物P調(diào)后，應(yīng)在原目的片段基礎(chǔ)上加約200bp長度，再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)得到得到我們所要的重組DNA。篩選出陽性克隆子進行質(zhì)粒提取及單、雙酶切五、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21plyst，搖菌進行SDS電泳。（一）Cry1Ac結(jié)構(gòu)域基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達1、將陽性克隆子分別進行質(zhì)粒提取，再分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli)BL21Plyst表達菌株，涂平板，37℃培養(yǎng)過夜。2、菌種活化：5mL培養(yǎng)基的試管中各加入氨芐，搖勻。用10uL無菌槍頭挑取單菌落，接種。放入到搖床中，180r/min，37℃，振蕩培養(yǎng)12h。取出活化好的菌種。先在100mL的培養(yǎng)基中滴入氨芐，搖勻。按1%的量接種，放到搖床中，