儀器分析梯度洗脫技術(shù)李鋒講師知識(shí)點(diǎn)主要內(nèi)容梯度的定義梯度系統(tǒng)—“高壓混合”HPLC系統(tǒng)—“低壓混合”HPLC系統(tǒng)梯度延遲或死體積流動(dòng)相的選擇最佳的色譜條件梯度洗脫常見的問(wèn)題梯度洗脫技術(shù)梯度的定義流動(dòng)相的組成或流速隨洗脫時(shí)間的變化而變化—起始為弱洗脫能力的溶劑，隨著時(shí)間的推移逐步變?yōu)橄疵撃芰^強(qiáng)的溶劑—慣例oA通常是洗脫能力較弱的溶劑或者流動(dòng)相oB通常是洗脫能力較強(qiáng)的溶劑或者流動(dòng)相梯度洗脫技術(shù)為什么要進(jìn)行梯度洗脫？

-樣品在色譜柱上有寬范圍的保留

-能夠增加峰容量，更好的對(duì)復(fù)雜包含多種物質(zhì)的組分進(jìn)行強(qiáng)有力的分離

-使峰形變窄

-單位時(shí)間內(nèi)的分離能力增加，有效的縮短分析時(shí)間梯度洗脫技術(shù)梯度洗脫系統(tǒng)的類型“高壓”系統(tǒng)—溶劑混合處在泵的高壓一側(cè)，即混合點(diǎn)處于泵頭之后“低壓”系統(tǒng)—溶劑混合處在泵的低壓一側(cè)，即混合點(diǎn)處于泵頭之前梯度洗脫技術(shù)“高壓”梯度系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)—系統(tǒng)體積小—沒(méi)有嚴(yán)格的在線脫氣機(jī)要求缺點(diǎn)—一個(gè)泵只能控制一路溶劑—最多僅允許三路溶劑（通常二路）梯度洗脫技術(shù)“低壓”梯度系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)—只需一個(gè)泵頭—同時(shí)使用多種溶劑（通常不超過(guò)四種）缺點(diǎn)—較大的系統(tǒng)體積—需要在線脫氣梯度洗脫技術(shù)梯度滯后體積與死體積新系統(tǒng)<1ml(Waters2695<650ul)較早的系統(tǒng)一般都是幾個(gè)ml梯度洗脫技術(shù)梯度方法轉(zhuǎn)化實(shí)例梯度洗脫技術(shù)了解滯后體積的重要性當(dāng)梯度方法從一個(gè)色譜系統(tǒng)上轉(zhuǎn)化到另外一個(gè)色譜系統(tǒng)上時(shí)，滯后體積的不同能夠改變保留時(shí)間和分離度需要對(duì)不同系統(tǒng)的滯后體積進(jìn)行確定當(dāng)進(jìn)行梯度梯度方法開發(fā)時(shí)，要考慮不同系統(tǒng)的滯后體積的不同，這樣才能更加容易的在不同系統(tǒng)上進(jìn)行梯度方法的轉(zhuǎn)換梯度洗脫技術(shù)梯度洗脫時(shí)的溶劑選擇A（弱洗脫溶劑）溶劑的洗脫能力應(yīng)該盡量的小，這樣才能夠使最快洗脫的物質(zhì)有一個(gè)很合理的保留（K>1）B（強(qiáng)洗脫溶劑）溶劑的洗脫能力應(yīng)該非常的強(qiáng)，這樣才能夠使最晚出峰的物質(zhì)有一個(gè)合理的保留（K<20）A和B應(yīng)該能夠非常好的混合A和B應(yīng)該盡量的沒(méi)有粘滯性梯度洗脫技術(shù)梯度洗脫時(shí)的注意事項(xiàng)平衡時(shí)間流動(dòng)相的兼容性要求高純度的流動(dòng)相（包括水）以及各種添加劑通常需要進(jìn)行空白梯度實(shí)驗(yàn)當(dāng)估算色譜分析時(shí)間時(shí)，需要回到起始比例重新平衡色譜柱重現(xiàn)性梯度洗脫技術(shù)色譜參數(shù)的優(yōu)化起始比例結(jié)束比例梯度分析時(shí)間總運(yùn)行時(shí)間曲線類型梯度類型（二元，三元，四元）流速梯度洗脫技術(shù)常規(guī)的梯度起始比例在15到25分鐘內(nèi)，B流動(dòng)相從10變到100%流速為1-2ml/min選擇合適的起始比例（B%）和結(jié)束比例，梯度時(shí)間，流速梯度洗脫技術(shù)優(yōu)化實(shí)例梯度洗脫技術(shù)優(yōu)化實(shí)例梯度洗脫技術(shù)梯度洗脫的問(wèn)題當(dāng)色譜柱初始使用純水平衡時(shí)，水中的有機(jī)物將在色譜柱上富集，隨著梯度變化時(shí)，有機(jī)物將被洗脫出來(lái)梯度洗脫技術(shù)總結(jié)理解HPLC的滯后體積和系統(tǒng)死體積進(jìn)行梯度空白