高效液相色譜和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析天花粉蛋白胰酶肽圖譜維普資訊////0>.研究論文生命科學(xué)儀器第卷/第期高效液相色譜和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析天花粉蛋白胰酶肽圖譜喻志強(qiáng),唐辰虹,施榮華,吳高,羅昭鋒.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,生命科學(xué)學(xué)院,合肥安徽.安徽醫(yī)科大學(xué)老年醫(yī)學(xué)教研室,合肥安徽摘要目的:建立了檢測(cè)天花粉蛋,肽圖譜方法。方法:采用反相高效液相色譜法和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜??法對(duì)天花粉蛋白的肽圖譜進(jìn)行了測(cè)定,比較了不同批次產(chǎn)品一級(jí)結(jié)構(gòu)的一致性,并用??法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果:用?和??法檢測(cè)天花粉蛋白胰酶裂解后的肽段,發(fā)現(xiàn)各批產(chǎn)品的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有一致性,此分析方法具有簡(jiǎn)單,靈敏度高,可靠等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論:本法適應(yīng)于天花粉蛋白藥物的肽譜分析,同時(shí)也為分析修飾天花粉蛋白藥物肽圖譜提供了可以借鑒定手段。關(guān)鍵詞反相高效液相色譜,天花粉蛋白,肽圖譜,基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速,有效地進(jìn)行了的肽譜分離,這些嘗試希前言望能對(duì)修飾的蛋白質(zhì)藥物鑒定提供可供借鑒方法。本方法也為檢測(cè)蛋白藥物提供了一種可供借鑒肽圖譜分析是鑒定蛋白藥物的重要手段。目前的手段。主要用于肽圖譜分析的主要方法是法,法,質(zhì)譜法等?，F(xiàn)已有多種蛋白用法進(jìn)行肽譜試驗(yàn)部分分析報(bào)道,包括人生長(zhǎng)激素,人粒細(xì)胞集落刺激因子.儀器和試劑及修飾人生長(zhǎng)刺激蛋白,引。肽圖法已成為Ⅲ??德國(guó)公司,在蛋白質(zhì)及多肽分析中最重要、最廣泛的應(yīng)用,型酸度計(jì)上海分析儀器廠無錫分廠;已用于重組蛋白質(zhì)量控制、疾病診斷等諸多領(lǐng)域。天花粉蛋,是中藥天花粉的型液相色譜,監(jiān)測(cè)器;反有效成分,傳統(tǒng)上用于早期引產(chǎn),治療葡萄胎?。同時(shí)卡目柱?.×公司。還是一種有前途的抗腫瘤藥物,具有一糖天花粉蛋白來自安科生物工程股份;苷酶活性,在臨床上對(duì)愛滋病治療也具有令人鼓舞【氫基,?羥基肉桂酸為公司產(chǎn)品,的運(yùn)用前景。最近在運(yùn)用基因工程定點(diǎn)突變或化胰蛋白酶為公司商品,經(jīng)過甲苯黃酰一一苯丙氨酸氯甲基酮預(yù)處理;三氟乙酸德國(guó)學(xué)修飾手段對(duì)蛋白共價(jià)修飾,如蛋白的聚公司;磷酸二氫鈉;氫氧化鈉;鹽酸;乙腈乙二醇,修飾研究已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者濃厚興趣,因?yàn)榫垡叶脊矁r(jià)修飾蛋白均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｙ|(zhì)藥物具有如下優(yōu)點(diǎn),可以消除蛋白質(zhì)藥物的抗原.溶液的配置性及免疫原性延長(zhǎng)小分子多肽在體內(nèi)的半衰期。但..色譜流動(dòng)相流動(dòng)相:取三氟乙酸于水中;流是由于修飾后蛋白質(zhì)一般為較復(fù)雜的混合物,動(dòng)相:取三氟乙酸于乙腈中,..使這是由于被修飾蛋白質(zhì)上待連接的活性位點(diǎn)的活性用前均經(jīng).濾膜抽濾脫氣。不同,空間位阻不同導(dǎo)致每個(gè)蛋白分子上連接的數(shù)和連接的位置不同,因此修飾后的蛋白..酶解樣品經(jīng)過純化和修飾的特定位點(diǎn)及特定位點(diǎn)被修飾程度取冷凍干燥后的天花粉酶解粉末,溶解在的檢測(cè),才有可能成為安全有效的蛋白質(zhì)藥物。雙蒸餾水中,溶液濃度為/。.方法本文以天花粉蛋白為模式蛋白,運(yùn)用?..天花粉蛋白的胰蛋白酶酶切分離技術(shù),同時(shí)結(jié)合??法,可維普資訊////.研究論文生命科學(xué)儀器第卷/第期方法】取天花粉蛋白,加人./含有個(gè)氨基酸,中含有個(gè)和尿素,在%沸水中加熱,加入.雙蒸水個(gè),理論上應(yīng)有個(gè)裂解位點(diǎn),產(chǎn)生個(gè)肽段,和../,溶液,震蕩,%酶解,但由于酶解不完善或在非,殘基上切斷,產(chǎn)生冷凍干燥。肽段數(shù)不一定與理論值相符。..?分離條件從肽譜圖看,測(cè)定了約個(gè)肽段分子量,其中色譜條件:色譜柱為反相柱一Ⅱ有幾個(gè)肽段為胰酶自降解肽段,還有幾個(gè)肽段為酶.,柱溫℃,流速./,檢解不完全或非特異性降解產(chǎn)生,如:肽段,,,非特異性降解,分子量為.,.肽段測(cè)波長(zhǎng)。二元洗脫梯度為:在內(nèi)流動(dòng)相由%到%。程序結(jié)束后,色譜柱用流動(dòng)相清為胰酶自降解峰。經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫輔助分析,其中有洗.每次進(jìn)樣體積,樣品濃度為,個(gè)肽段的與理論值個(gè)肽段相符,匹配度達(dá)重復(fù)次進(jìn)樣。.%,匹配情況見表。..??條件檢測(cè)條件:激光器,激光波長(zhǎng);速電壓;基質(zhì)一氫基,?羥基肉桂酸用%乙腈溶液飽合;樣品水溶液與基質(zhì)混合后,滴于不銹鋼靶上,空氣中自然干燥后,推人離子源中測(cè)定。圖上圖表示酶解肽段?色譜圖結(jié)果色譜條件:色譜柱為反相柱一¨.,柱溫℃流速/,檢測(cè)波長(zhǎng)洗脫梯度:在內(nèi)流動(dòng)相由%上升%.?法分析的肽圖譜從色譜圖看,在上述色譜條件下,大約有個(gè)左右酶解肽段得到基線分離,酶解肽段分離是相當(dāng)成功的,因?yàn)橐让该附夂罄碚撾亩委B星數(shù)目為,同時(shí)這也暗示;§酶解相當(dāng)完全而且特異..引.和性也比較高。另外從三批酶解肽段的色譜圖譜圖譜沒有給出,各批間的肽譜幾乎一致,各峰數(shù)目和保留時(shí)間也大致相同。冕專.??法分:翌析肽圖譜疊矗;酶解肽段的譜肽圖,可見圖僅測(cè)??.“部分,共測(cè)定幾個(gè)肽段,各肽段的分子量較圖胰酶酶切??肽圖譜肽圖譜圖更直觀。注:上面圖實(shí)際上為同一肽譜圖,其橫坐標(biāo)范圍為?維普資訊////.研究論文生命科學(xué)儀器第卷/第期表胰蛋白酶酶切?結(jié)構(gòu)之間的同一性,確認(rèn)基因工程上游和下游處理過肽圖譜計(jì)算機(jī)輔助分析結(jié)果程中是否發(fā)生差錯(cuò)、重組產(chǎn)物中是否存在轉(zhuǎn)譯后化學(xué)修飾及預(yù)期氨基酸的變異等,而且不同批次產(chǎn)品的肽圖譜的比較可驗(yàn)證工藝過程的穩(wěn)定性,因此肽圖分析在基因工程產(chǎn)品質(zhì)控中尤為重要.法已成為肽圖分析的最常規(guī)手段之一,??法同樣可進(jìn)行肽圖分析,質(zhì)譜法一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行混合物的分析,在一次測(cè)定中可給出混合物中所有物質(zhì)準(zhǔn)確的分子量,它與酶解或化學(xué)降解相結(jié)合是確認(rèn)基因工程藥物與天然組分一級(jí)結(jié)構(gòu)一致性的好方法,具有快速、準(zhǔn)確、結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn).本文以天花粉蛋白為模式蛋白,運(yùn)用?分離技術(shù),同時(shí)結(jié)合??法,快速,有效地進(jìn)行了的肽譜分離,這些嘗試希望能對(duì)修飾的蛋白質(zhì)藥物鑒定提供可供借鑒方法,此方法也為其它重組和修飾蛋白藥物一級(jí)結(jié)構(gòu)的分離提供了一種快速,簡(jiǎn)便的方法。參考文獻(xiàn),...,,:~,,,....,,:?,,,.....,,:?考慮到質(zhì)譜測(cè)定時(shí)上樣微量化,樣品與基質(zhì)混汪猷,金善偉.天花粉蛋白】.北京:科學(xué)出版社,:合不均一化因素,混合肽段中微量樣品可能不能完張勁松,劉望夷.天花粉蛋白的作用機(jī)制一糖苷酶全檢測(cè)出來,在本試驗(yàn)中,收集了?分離后型.生物化學(xué)和生物物理進(jìn)展,:?;?.??各個(gè)組分,進(jìn)行離線?測(cè)定,發(fā)現(xiàn)個(gè)肽?.段的測(cè)定分子量與理論分子量一致,匹配度達(dá).,,.%,其中組分在測(cè)定酶解混合物質(zhì)譜時(shí)沒有找..到,而在混合肽段中能測(cè)定出來的肽段,均可在離線:.?中貝定出來,兩者結(jié)果相差不是很大,說,,,.?明酶解程度和質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度都很高,結(jié)果??.可信度好。,,:?將測(cè)定的肽譜數(shù)據(jù)輸入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,如汪猷,顧梓偉,葉國(guó)杰.,苦瓜子胰蛋白酶抑制