4.天然藥物有效成分的分離純化方法1）根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離

結(jié)晶法、沉淀法、鹽析法

2）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離

液－液萃取法、逆流分溶法（CCD）液滴逆流色譜法（DCCD）高速逆流色譜法（HSCCC）氣液分配色譜法（GC或GLC）液液分配色譜法（LC或LLC）3）根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離

硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺、大孔吸附樹脂

4）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離

透析法、凝膠過濾法、超濾法、超速離心法、膜分離5）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離

離子交換法、電泳4.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）chromato：色 graphy：記錄方法1906年層析法問世俄羅斯植物學(xué)家茨維特（Tswett）用液固吸附層析分離了植物色素層析法是利用不同化合物在互不相溶的兩相中的親和力的不同來分離物質(zhì)的一種方法。色譜技術(shù)的應(yīng)用：分離制備化合物單體4.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）

分離的原理：三者之間反復(fù)多次作用，不同的化合物因作用力不同，產(chǎn)生差時遷移（differentialmigration）

色譜三要素：

固定相（stationaryphase）流動相（mobilephase)

待分離的物質(zhì)4.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）4.2.1層析法的分類4.2.2吸附層析法4.2.3分配層析法4.2.4尺寸排阻層析法4.2.5離子交換層析法4.2.1層析法的分類1）根據(jù)兩相的狀態(tài)劃分⊙液相層析法(liquidchromatography，LC)*液-固層析法(liquid-solidchromatography)

*液-液層析法(liquid-liquidchromatography)

*膠束電動色譜(micellarelectrokineticchromatogranphy)⊙氣相層析法(gaschromatography，GC)*氣-固層析法(gas-solidchromatography)*氣-液層析法(gas-liquidchromatography)⊙超臨界流體層析法

(supercriticalfluidchromatography，SFC)4.2.1層析法的分類2）根據(jù)固定相使用的形式劃分柱層析法(columnchromatography)

薄層層析法(thin-layerchromatography)

紙層析法(paperchromatography)

逆流層析法(countercurrentchromatography)

4.2.1層析法的分類3）根據(jù)層析過程的機(jī)理劃分吸附層析法(adsorptionchromatography)

分配層析法(partitionchromatography)

尺寸排阻層析法(size-exclusionchromatography)

*分子篩過濾層析法(molecularsievefiltration)*凝膠過濾層析法(gelfiltration)*凝膠滲透層析法(gelpermeationchromatography)離子交換層析法(ion-exchangechromatography)

親和色譜法（affinitychromatography）正相層析:流動相的極性低于固定相的極性,溶出成分極性由弱到強(qiáng).反相層析:流動相的極性高于固定相的極性,溶出成分極性由強(qiáng)到弱.4.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）4.2.1層析法的分類4.2.2吸附層析法4.2.3分配層析法4.2.4尺寸排阻層析法4.2.5離子交換層析法1）吸附作用

*物理吸附(physicaladsorption):分子間作用力*化學(xué)吸附(chemicaladsorption)

*半化學(xué)吸附(semi-chemicaladsorption)

：氫鍵作用4.2.2吸附層析法（adsorptionchromatography)被分離物質(zhì)吸附劑洗脫劑吸附層析三要素2）物理吸附基本規(guī)律----相似者易于吸附

4.2.2吸附層析法（adsorptionchromatography)①化合物極性的強(qiáng)弱的判斷

a.化合物的極性由分子中所含官能團(tuán)的種類、數(shù)目及排列方式等綜合因素所決定.b.官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱順序

R-COOH>Ar-OH>H-OH

>R-OH>R-NH2,R-NH-R’,R-N-R’’>R-CO-N-R’’

>

R-CHO>R-CO-R’>R-COOR’>R-O-R’>R-X>R-H

c.溶液中酸性、堿性及兩性有機(jī)化合物的極性強(qiáng)弱受溶液pH影響.

R’R’4.2.2吸附層析法2）物理吸附基本規(guī)律----相似者易于吸附

②溶劑的極性強(qiáng)弱:介電常數(shù)③常用的固定相吸附劑

無機(jī)吸附劑:硅膠、氧化鋁、活性炭等有機(jī)吸附劑:聚酰胺、大孔吸附樹脂等

3）簡單吸附法進(jìn)行物質(zhì)的濃縮與精制

*用活性炭脫色、脫臭*從大量稀水溶液中濃縮微量物質(zhì)

石油醚≈正己烷＜苯＜二氯甲烷＜無水乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸4）常用的吸附層析法①硅膠（silicagel）層析硅膠G，硅膠H，硅膠GF254，硅膠HF254

硅膠HF254＋365，硅膠CMC，硅膠60★硅膠的吸附性能取決于：

a.硅羥基的數(shù)目

b.含水量:>12%時吸附力極弱

c.硅膠的表面積、表面結(jié)構(gòu)、微孔體積、微孔半徑等

4.2.2吸附層析法★硝酸銀硅膠：分離不飽和雙鍵的幾何異構(gòu)體★硅膠薄層板的活化：100~110oC,30min4.2.2吸附層析法4）常用的吸附層析法①硅膠層析★硅膠層析的應(yīng)用：酸性或中性化合物★硅膠柱層析法的使用方法

●層析硅膠的用量

:1:30>60

●層析柱的制備與加樣

●層析溶劑的選擇：TLC;洗脫順序（正相色譜）

●硅膠的再生

②氧化鋁（alumina）層析

堿性化合物的分離，如：生物堿正相層析:移動相的極性低于固定相的極性,溶出成分極性由弱到強(qiáng).反相層析:移動相的極性高于固定相的極性,溶出成分極性由強(qiáng)到弱.4.2.2吸附層析法

③活性炭（activecarbon）層析

●非極性吸附劑●水溶液中吸附力最強(qiáng)，有機(jī)溶劑中較弱★對不同化合物的吸附力大?。?/p>

◎極性基團(tuán)多的化合物＞極性基團(tuán)小的化合物◎芳香族化合物＞脂肪族化合物◎大分子量化合物＞小分子量化合物★應(yīng)用：

水溶性芳香族化合物與脂肪族化合物的分離

單糖與多糖的分離氨基酸與多肽分離4.2.2吸附層析法④聚酰胺層析a.聚酰胺的性質(zhì)及吸附原理

聚酰胺polyamide，錦綸、尼龍*親水性和親脂性*可分離水溶性成分和脂溶性成分吸附原理：——氫鍵吸附4.2.2吸附層析法④聚酰胺層析b.含水溶劑中化合物結(jié)構(gòu)對吸附性能的影響★形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，吸附力越強(qiáng)★易形成分子內(nèi)氫鍵者，吸附力減弱?！锓枷慊潭雀哒?，吸附力增強(qiáng)。c.溶劑對吸附性能的影響☆各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力:

水<甲醇<丙酮<NaOH水溶液<甲酰胺<二甲基甲酰胺<尿素水溶液

4.2.2吸附層析法④聚酰胺層析☆聚酰胺的“雙重色譜”性能

:

含水溶劑為移動相時，聚酰胺為非極性固定相，其色譜行為類似于反相色譜；

非極性溶劑氯仿－甲醇為移動相時，聚酰胺為極性固定相，其色譜行為類似于正相色譜。

d.聚酰胺的精制及再生

e.聚酰胺層析的應(yīng)用

*特別適合于酚類、黃酮類化合物的制備與分離*脫鞣質(zhì)處理*對生物堿、萜類、甾類、糖類、氨基酸等其他極性與非極性化合物的分離也有廣泛的應(yīng)用。

*聚酰胺板（薄膜）洗脫劑：水→醇4.2.2吸附層析法④聚酰胺層析

50%甲醇溶液70%甲醇溶液干法上柱先水洗去糖實例：4.2.2吸附層析法4）常用的吸附層析法⑤大孔吸附樹脂（macroporousadsorptionresin）層析

●大孔吸附樹脂：不含離子交換基團(tuán)的具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，多為苯乙烯型或2-甲基丙烯酸酯型。●特點：多孔性；較大的比表面積；吸附容量大?！裎皆恚何叫浴兜氯A引力或氫鍵

分子篩性——多孔性●影響吸附的因素：

a.大孔吸附樹脂本身的性質(zhì)：孔徑、表面積、表面電性、能否與化合物形成氫鍵等

b.溶劑的性質(zhì)

c.化合物自身的性質(zhì)：分子量、極性、氫鍵作用等4.2.2吸附層析法●應(yīng)用：從水溶液中分離低極性或非極性化合物，組分間極性差別越大，分離效果越好。

如：黃酮類、皂苷類、生物堿類、酯類、萜類等●使用方法

a.預(yù)處理：除去雜質(zhì)，恢復(fù)孔的大小水――乙醇――甲苯――乙醇――水

b.使用：

*樣品一般用水溶液上柱。*洗脫：非極性樹脂：水－含水醇－醇－丙酮－乙酸乙酯極性樹脂：極性較大的溶劑洗脫

4）常用的吸附層析法⑤大孔吸附樹脂層析

常用樹脂：AmberliteXAD系列，D-101、DA-201、HPD系列等4.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）4.2.1層析法的分類4.2.2吸附層析法4.2.3分配層析法

4.2.4尺寸排阻層析法4.2.5離子交換層析法4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2.3分配層析法●原理:利用混合物中的各成分在兩種互不相溶的溶劑

中的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的目的。分配系數(shù)相差越大,分離效率越高。

4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)1）分配系數(shù)K

指溶質(zhì)溶解在兩種共存的互不相溶的溶劑時,其在兩相溶劑中的分配比(K)。在一定溫度及壓力下，K為一常數(shù)。

即K=Cu/CL

2）分離因子b

分離因子b:A、B兩種溶質(zhì)在同一溶劑系統(tǒng)中

的分配系數(shù)的比值.

b=KA/KB

分離因子b反映了兩化合物分離的難易.

b=1:A和B不能分離

b>1或b<1:A和B可分離

4.2.3分配層析法4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)b≥1001次100＞b≥1010～12次b≤2100次以上3）分配系數(shù)與pH

對于酸性、堿性或兩性有機(jī)化合物，溶液pH的變化可改變化合物的存在狀態(tài)，進(jìn)而影響其在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù).pH＜3時,

酸性物質(zhì)多呈非解離狀態(tài),堿性物質(zhì)多呈解離狀態(tài)

pH＞12時,酸性物質(zhì)多呈解離狀態(tài),堿性物質(zhì)多呈非解離狀態(tài)

羧酸類：pKa約為5

酚類：pKa9.2～10.84.2.3分配層析法4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)酸性化合物HA：

pH=pKa＋2（A－）

pH=pKa－2（HA）pH梯度萃取分離法pH=pKa+lg[A-]/[HA]4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3分配層析法

利用紙層析可選擇設(shè)計液－液萃取分離物質(zhì)的最佳方案。

4）液－液萃取與紙層析r：紙層析定數(shù)，當(dāng)層析濾紙濕重為干重的1.5倍時，r＝2。4.2.3分配層析法4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)5）萃取過程中易發(fā)生乳化現(xiàn)象發(fā)生乳化后的處理方法：

★將乳狀液離心分離.★將乳狀液抽濾.★將乳狀液加熱或冷凍.★加入電解質(zhì)，如：NaCl,Na2SO4,MgSO4等★將乳狀液分開,再換新溶劑萃取.★加入表面活性更大的表面活性劑，如:戊醇.4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2.3分配層析法是一種連續(xù)的兩相溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加兩相溶劑萃取時的接觸面。兩種裝置類型：*比水輕的溶劑：如正己烷*比水重的溶劑：如氯仿萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進(jìn)行檢查。4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3分配層析法4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2.3分配層析法4.2.3.3逆流分溶法CounterCurrentDistributionCCD法是指經(jīng)過多次、連續(xù)的液-液萃取分離過程，使溶質(zhì)在兩相溶劑相對作逆流移動過程中不斷地重新分配并達(dá)到分離目的的一種分離方法。萃取分離過程：

振搖萃取（a）—靜置分層（b）—兩相分開(c)—轉(zhuǎn)移(d）優(yōu)點：適于分離性質(zhì)非常相似的混合物缺點：操作時間長，易產(chǎn)生乳化，萃取管易因機(jī)械振蕩而損壞，消耗溶劑亦多，應(yīng)用上常受到一定限制。4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2.3.4液滴逆流層析法：(Droplet

CountercurrentChromatography,DCCC)分離過程：移動相呈液滴形式相對于固定相垂直上升或下降。在細(xì)的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進(jìn)溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配。4.2.3分配層析法4.2.3分配層析法優(yōu)點：分離效果往往比逆流分溶法好，且不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。缺點：流速慢，分離時間長；固定相與流動相間的傳質(zhì)交換不夠充分。對溶劑系統(tǒng)的要求及應(yīng)用的局限性必須選用能生成液滴的溶劑系統(tǒng)，且對高分子化合物的分離效果較差，處理樣品量?。?克以下），并要有一定設(shè)備。4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2.3分配層析法4.2.3.5高速逆流色譜（HighSpeed

CountercurrentChromatography,HSCCC）物體在旋轉(zhuǎn)螺旋管里的運(yùn)動狀態(tài)示意圖

1．首端；2．玻璃珠；3．鉛粒；4．氣泡；5尾端．兩相溶劑分配平衡時：輕相總在頭，重相總在尾輕相為固定相：從頭到尾重相為固定相：從尾到頭

分離系統(tǒng)：互不相溶的兩相溶劑：兩相溶劑的體積應(yīng)盡量相同，分層時間（<30秒)，以得到滿意的固定相保留率分配系數(shù)(K)的選擇:上相中樣品濃度/下相中樣品濃度0.2～2,1最佳樣品各組分間的分離因子(,各組分的K值之比)>1.5

溶劑系統(tǒng)：化合物極性溶劑系統(tǒng)強(qiáng)極性正己烷/正丁醇/甲醇/水中極性正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水非極性正己烷/乙腈溶劑比例的優(yōu)化一次只改變一種溶劑的量取少量樣品在試管中進(jìn)行分配系數(shù)實驗

TLC或HPLC測定實驗結(jié)果4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2.3分配層析法4.2.3.6液-液分配柱層析1）正相層析與反相層析正相層析:移動相的極性低于固定相的極性,溶出成分極性由弱到強(qiáng).反相層析:移動相的極性高于固定相的極性,溶出成分極性由強(qiáng)到弱.

將兩相溶劑中的一相涂覆在硅膠等多孔載體上，作為固定相，填充在色譜管中，然后加入與固定相不相混溶的另一相溶劑（流動相）沖洗色譜柱。原理：分配層析固定相載體：硅膠、硅藻土、纖維素粉等正相分配層析：(Normalphasepartitionchromatography)

固定相：水、緩沖溶液流動相：固定相飽和的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等弱極性有機(jī)溶劑洗脫順序：化合物極性由小到大依次溶出應(yīng)用：通常用于分離水溶性或極性較大的成分反相分配層析：(Reversedphasepartitionchromatography)

固定相：石蠟油、化學(xué)鍵合固定相（RP-18,RP-8,RP-2等）流動相：水和甲醇、或乙腈等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑洗脫順序：化合物極性由大到小依次溶出應(yīng)用：適合于分離脂溶性或極性較小的化合物化學(xué)鍵合相色譜（bondedphasechromatography）

指通過化學(xué)反應(yīng)使固定相與載體表面的特定基團(tuán)（如硅膠表面上的硅醇基）發(fā)生化學(xué)鍵合，在載體表面形成均勻的固定相層用于分離的色譜方法。非極性鍵合硅膠：C18（ODS）、C8、C2、Phenyl-等。

1）反相色譜固定相。

2）烷基鏈長和鍵合量是影響固定相樣品容量、溶質(zhì)保留值、柱效和分離選擇性等色譜性能的重要參數(shù)。極性鍵合硅膠：-CN，-NH2，二醇基等。

1）多采用非極性或弱極性溶劑，形成正相色譜體系。

2）對于強(qiáng)極性化合物，也可用于反相色譜。

3）分離選擇性取決于鍵合相種類、溶劑強(qiáng)度和樣品性質(zhì)，其中溶質(zhì)與固定相上極性基團(tuán)間作用力是決定色譜保留與分離選擇性的首要因素。大小分離規(guī)?？焖賹游?flashchromatography)約2大氣壓低壓液相層析(LPLC)小于5大氣壓中壓液相層析(MPLC)5-20大氣壓高壓液相層析(HPLC)>20大氣壓2）加壓液相柱層析容量因子k

：反映溶質(zhì)分子在柱中的移動速度k=（tR-t0）／t0=t’R／t0

3）制備性分離

優(yōu)化色譜條件：等度分離條件；分離度a>1.5；容量因子k<2(混合物時，k2~8）制備型分離需考慮的兩個因素：

*生產(chǎn)能力*產(chǎn)品純度*濃度過載*體積過載逆流層析法與液－液分配柱層析法的比較:

1）運(yùn)作成本低：不需昂貴的色譜柱及高純度的流動相溶劑，樣品亦不需嚴(yán)格的預(yù)處理，藥材提取物溶解后即可直接上樣進(jìn)行分析。2）制備樣品量大：除了可應(yīng)用于指標(biāo)成分化學(xué)對照品的制備上之外，還可用于藥效活性部位的篩選研究中，為藥理活性試驗提供足夠的供試樣品，為中草藥或中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明以及創(chuàng)新藥物的開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。3）不會產(chǎn)生不可逆吸附：因為沒有固體載體。4.2.3分配層析法4.2.3分配層析法(partitionchromatography)4.2.3.1兩相溶劑萃取法(液-液分配萃取法)4.2.3.2逆流連續(xù)萃取法4.2.3.3逆流分溶法4.2.3.4液滴逆流層析法4.2.3.5高速逆流色譜4.2.3.6液-液分配柱層析4.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）4.2.1層析法的分類4.2.2吸附層析法4.2.3分配層析法4.2.4尺寸排阻層析法4.2.5離子交換層析法4.2.4尺寸排阻層析法

(sizeexclusionchromatography)凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)凝膠滲透層析(gelpermeationchromatography)分子篩過濾層析(molecularsievefiltrationchromatography)1）原理:分子大小不同,滲入凝膠顆粒內(nèi)部的程度也不同,

按照分子由大到小的順序先后流出并分離Ve=K1–K2lgM

Ve:洗脫體積，M：分子量

2）常用的凝膠種類及其性質(zhì)a）葡聚糖凝膠SephadexG：分子篩作用,如：G-25

分離多糖、蛋白質(zhì)等b）羥丙基葡聚糖凝膠SephadexLH-20：分子篩作用、反相分配色譜粗分，精分都可以再生：洗脫過程就是再生過程LH-20溶脹體積表

溶劑（mL∕g干膠粉末）溶脹體積溶劑（mL∕g干膠粉末）溶脹體積二甲基亞砜4.4-4.6異丙醇3.3-3.6嘧啶4.2-4.4四氫呋喃3.3-3.6水4.0-4.4二惡烷3.2-3.5二甲基甲酰胺4.0-4.4丙酮2.4-2.6生理鹽水3.8-4.2乙腈2.2-2.4甲醇3.9-4.1四氯化碳1.8-2.2二氯乙烷3.8-4.1苯1.6-2.0氯仿3.8-4.1乙酸乙酯1.6-1.8丙醇3.7-4.0甲苯1.5-1.6乙醇3.6-3.9異丙醇3.3-3.6異丁醇3.6-3.9四氫呋喃3.3-3.6甲酰胺3.6-3.9二惡烷3.2-3.5二氯甲烷3.6-3.9丙酮2.4-2.6丁醇3.5-3.8乙腈2.2-2.44.2層析法

（色譜法、色層法，Chromatography）4.2.1層析法的分類4.2.2吸附層析法4.2.3分配層析法4.2.4尺寸排阻層析法4.2.5離子交換層析法4.2.5離子交換層析法1）原理：離子交換

利用大分子樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的交換基團(tuán)而進(jìn)行的交換性柱層析方法。流動相為含水溶液，通過調(diào)整鹽濃度、pH值進(jìn)行洗脫。2）離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其分類

a)母核：苯乙烯－二乙烯苯

b)離