第三章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序01DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1、DNA體外擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA熱變性的原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合②PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)2、DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳②在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)③凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)3、材料儀器PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置4、實(shí)驗(yàn)材料4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物耐高溫的DNA聚合酶、模板DNA

擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液瓊脂糖、核酸染料等PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul總體積50ul5、實(shí)驗(yàn)步驟加樣離心擴(kuò)增配置瓊脂糖溶液制備凝膠電泳加樣電泳、觀察6、注意事項(xiàng)①PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理②

緩沖液和酶使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化③在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換④

在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套⑤PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因？如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火