關于生物酶解技術第1頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞壁的層次胞間層（中層）(middlelamella):果膠類物質組成，具強的親水性和可塑性。初生壁(primarywall)：細胞生長過程中，原生質分泌，有纖維素、半纖維素和果膠，還含有酶和糖蛋白。次生壁(secondarywall)：細胞停止生長，原生質產生的壁物質沉積在初生壁內側。由纖維素、半纖維素和木質素構成。分內層(S3)、中層(S2)和外層S1)。生物酶解技術在中藥提取中的應用第2頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞壁的化學組成纖維素(cellulose):由葡萄糖分子串聯(lián)而成。結構單位：微團(micelle)、微纖絲(microfibre)、大纖絲(macrofibre)

纖維素的網(wǎng)絡結構中交聯(lián)半纖維素和果膠類物質。第3頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月目前，生物酶技術在現(xiàn)代中藥提取中正展示著其獨特的優(yōu)勢，引起了許多企業(yè)和科研單位的關注，并已經開始了在這一領域的探索和應用。世界上廣泛開展了有關酶的性質的研究，至今已從動物，植物中發(fā)現(xiàn)了兩千多種酶，并有兩百多種酶已得到結晶。第一節(jié)概述第4頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月一、酶的概念酶的概念—酶是由生物細胞產生的以蛋白質為主要成分的生物催化劑。

生物體內的反應是在很溫和的條件（如溫和的溫度、接近中性的pH）下進行的，而同樣的反應若在非生物條件下進行，則需要高溫、高壓、強酸、強堿等劇烈的條件。

第5頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的專一性每一種酶只能催化一種或一類的化學反應酶的催化效率是無機催化劑的107~1013

倍酶的高效性

酶的作用條件較溫和酶所催化的反應一般是在比較溫和的條件下進行的。第二節(jié)酶反應的特點與影響酶活性的因素一、酶反應的特點第6頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月酶活力:是酶促反應的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化的某一化學反應速度的快慢，即酶催化的反應速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。

二、酶活力與酶單位第7頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的定量并非對其蛋白質進行定量，而是對它的催化能力進行定量。所以，酶的定量就是測定酶的活力，也即測定酶促反應的速度。1.酶活力概念第8頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月A.國際單位(U)

這種單位是由國際酶學委員會規(guī)定的。

在標準條件(25℃、最適pH、最適底物濃度)下，酶每分鐘催化1mmol底物轉化，這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為1個國際單位(IU)。2.酶活力與單位第9頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)比活力是酶制劑純度的常用指標——比活力越大，表示酶越純比活力＝酶活力單位數(shù)（U）酶蛋白質量（mg）3.酶的比活力第10頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、影響酶活性的因素

酶解提取中藥有效成分，均有較高收率，具有較大應用潛力，但該技術也存在著局限性。酶法提取對生產條件要求較高，為使酶發(fā)揮最大作用，并將其用于工業(yè)化時，必須綜合考慮酶的濃度和底物濃度，溫度，pH，作用時間等對提取物的影響。第11頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

溫度對酶反應速度的影響具有雙重性：隨著溫度的升高，酶蛋白會失活，使反應速度下降

隨著溫度的升高，反應速度會加快1.溫度對酶反應速度的影響

因此，在這雙重因素的綜合作用下，酶促反應具有一最適溫度。第12頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月四.溫度對酶反應速度的影響

不同酶的最適溫度也不一樣。動物酶的最適溫度一般在35~40℃，植物酶為40~50℃。酶的最適溫度并非酶的特征性常數(shù)，它與底物、作用時間等因素有關。第13頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2.pH對酶反應速度的影響

pH對酶反應速度的影響較大。其原因有：

極端pH的條件引起酶蛋白的變性。pH影響底物的解離，從而影響酶與底物的結合。

pH影響酶分子解離狀態(tài)。

每種酶只能在一定的pH范圍內表現(xiàn)出它的活性，且在某一pH值范圍內活性最高，其兩側活性都下降。∴酶促反應具有一最適pH。第14頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月反應速度和pH的關系見下圖：

酶的最適pH一般在7左右。也有很多例外，如胃蛋白酶的最適pH只有1.5，木瓜蛋白酶(5.6)，胰蛋白酶(7.8)。酶的最適pH并非酶的特征性常數(shù)，它與底物的種類、濃度等因素有關。2.pH對酶反應速度的影響

第15頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月對于簡單的酶反應，當酶濃度和其他條件恒定時：v[S]0Vmax零級反應一級反應混合級反應

該曲線可以用米氏方程來描述3.底物濃度的影響第16頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4.酶濃度對酶反應速度的影響

在一般的酶促反應中，常常[S]>>[E]，酶反應速度達到最大反應速度。當[S]>>[E]，由于Vmax=k[E]0，∴反應速度與酶濃度成正比。

酶濃度曲線第17頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月某些物質能使酶的活性增強，成為酶的激活劑，某些物質能使酶的活性降低，成為酶的抑制劑。再如一些金屬螯合劑如EDTA（乙二胺四乙酸）等能除去重金屬離子對酶的抑制作用，也可視為酶的激活劑。第18頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月5.激活劑對酶反應速度的影響激活劑：能提高酶活性的物質。無機離子：主要是金屬離子，它們有的本身就是酶的輔助因子，有的是酶的輔助因子的必要成分。如:激酶需要Mg2+激活唾液淀粉酶需要Cl-激活主要的激活劑有：第19頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月5.激活劑對酶反應速度的影響有機小分子：一些還原劑，如抗壞血酸、半胱氨酸，使含-SH的酶處于還原態(tài)金屬螯合劑，如EDTA(乙二胺四乙酸)，可絡合一些重金屬雜質，解除它們對酶的抑制，從而使酶活升高。第20頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

抑制作用：有些物質與酶結合后，引起酶的活性中心或必需基團的化學性質發(fā)生改變，從而使酶活力降低或喪失。6.抑制劑對酶反應速度的影響第21頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)生物酶輔助提取中藥成分的機制酶解破壁

有效成分的提取

纖維素酶解提取

原理第22頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

內切葡聚糖酶纖維素酶纖維素二糖水解酶

β-葡萄糖苷酶

β甘露聚糖酶半纖維素酶β-木聚糖酶

β-葡萄糖苷酶

β-甘露糖苷酶

β-木聚糖苷酶果膠酶聚α-1,4半乳糖醛酸的聚糖水解酶果膠質?；饷傅?3頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月提高提取率加速有效成分釋放將植物組織溫和分解選用纖維素酶4.3.2.1.酶解優(yōu)點第24頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

第四節(jié)生物酶解輔助提取條件優(yōu)選一、酶輔助提取條件的優(yōu)選植物根莖類藥材——纖維素酶種子藥材——纖維素酶、半纖維素酶花類、果類——選用果膠酶動物藥材——蛋白酶（一）酶的種類1.酶對有效成分的影響催化水解酶(纖維素酶）對苷類藥材的影響P48第25頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2.復合酶的作用由于植物組織細胞壁的多樣性，有時采用復合酶，但由于復合酶的作用廣泛應考慮對有效成分的多重影響。有效成分含量明顯超過單一酶復合酶綜合作用有效成分含量低于單一酶第26頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月復合酶解法提取三七皂苷結果比較提取方法皂苷含量(%)平均纖維素酶解法9.468.789.469.23果膠酶酶解法8.908.649.168.90復合酶解法11.2611.3810.9711.17第27頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）酶解溫度溫度升高加速化學反應但酶的本質是（）所以溫度超過一定范圍（）所以對同一種酶在一定溫度范圍內活性隨（)升高而（）。對于對不同藥材酶的最適合的溫度可以通過實驗考查來確定。第28頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月方法固定酶的用量，作用時間，酶解液的PH值等相同的條件，將酶解液分成若干份，分別控制不同的溫度進行酶解反應，測定代表性的有效成分為考查指標，根據(jù)含量多少確定最合適的酶解溫度實例1.苦蕎莖葉粉中總黃酮酶法提取工藝研究第29頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月總黃酮的UV法測定法標準曲線的制備:將蘆丁于120℃烘箱中烘于干燥器中冷,卻后稱至恒重，稱取50mg用70%乙醇溶解,定容至250mL,得0.200mg/mL蘆丁對照品溶液。準確吸取蘆丁對照品溶液0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL于50mL量瓶中,加入5%NaNO2溶液15mL,搖勻,放置6min后加入10%Al(NO3)3溶液15mL,搖勻,放置6min后加入4%NaOH溶液20mL,再用70%乙醇定容,搖勻,第30頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月以70%乙醇為空白參比,10min后用1cm比色皿于510nm測定吸光度,得蘆丁的回歸方程:Y=0.0749A+0.0022(R2=0.9961)?？嗍w莖總黃酮的測定:準確稱取2.50g苦蕎莖葉粉,于250mL三角瓶中,加入50mL水,按試驗設置的處理條件,在不同的加酶量、酶解溫度和pH值條件下,酶解不同的時間,然后升溫至90℃提取,離心去沉淀,用70%乙醇定容至200mL,作為待測液。取3mL待測液于50mL量瓶中,按照標準曲線的制備項下方法測定吸光度,計算總黃酮的質量,并計算總黃酮得率(總黃酮得率=提取液中總黃酮質量/苦蕎莖葉粉質量×100%)。第31頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月單因素考查法（一）溫度第32頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）酶用量酶解溫度55，pH6.5酶解2小時纖維素酶第33頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）酸堿度固定纖維素酶的量，酶解溫度，時間2h，考查pH影響。第34頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）酶解時間固定：纖維素酶量，酶解溫度55pH6.5考查不同時間第35頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶解技術的工藝設計實例1.苦蕎莖葉粉中總黃酮酶法提取工藝研究1.酶解液黃酮成分測定2.正交實驗設計第36頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月由表中可知，各因素對提取效果的影響順序依次為A＞B＞C即酶解溫度酶解時間達到極顯著水平（P0.05）最佳工藝組合為A2B2C3第38頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月直接水提和酶法水提效果比較在酶解輔助提取過程中，酶的種類、酶解溫度，酶解時間及酸堿度各因素的影響不是孤立的，而是相互影響的，所以要在單因素考查的基礎上，通過正交試驗綜合考慮，以獲得更好酶解提取效果。第39頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)酶解技術在中藥提取中的應用一、酶解技術在中藥成分提取中的應用（一）多糖實例2.甘草多糖的酶輔助提取運用正交設計法設計酶法提取工藝，采用分光光度法測定多糖含量?！窘Y果】酶法提取甘草多糖的最佳工藝是溫度40℃、pH值5.0、加酶量5g?kg(-1)、提取時間5h。提取率3.29%酶法提取甘草多糖速度快，提取率高。第40頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月多糖的酶及超聲聯(lián)合提取

采用正交試驗,優(yōu)化玉米須多糖的酶及超聲提取方案,并研究這兩種方案的結合效果.結果三種提取工藝中聯(lián)合提取多糖得率最高,酶輔助提取次之,超聲提取最低.結論聯(lián)合提取是一條高效的提取路線.

方法超聲酶法酶法-超聲時間（min)20170190多糖含量%2.8785.6977.720第41頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）生物堿生物堿一般采取方法？酶法輔助提取率比傳統(tǒng)方法顯著增加，生物堿結構無（)鍵，不存在被酶水解問題。實例3.貝母生物堿酶輔助提取工藝研究（1）酶解條件單因素考查第42頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）酶解條件正交試驗pH溫度第43頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月由極差分析得到各因素對提取效果的影響度:A>D>B>C,由此可見,酶解溫度為主要因素,酶解時間為次要因素,其次是pH值,而酶用量的影響最小。因此得到最佳提取條件:提取溫度為60℃,pH值為45,酶用量為2.5g/L,提取時3.5h第44頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

驗證試驗:按原醇提取工藝進行3次試驗,同時根據(jù)正交試驗優(yōu)選結果對酶解工藝進行3次重復試驗,結果見表3。可見,兩工藝重現(xiàn)性良好,但是加酶工藝比不加酶收率提高了3.92%。第45頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶解技術在中藥成分轉化中的應用

研究證明,白藜蘆醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗過敏、降血脂和抗氧化等多方面的藥理活性,是目前研究較熱門而有希望的抗癌藥劑之一。

白藜蘆醇在虎杖中主要以苷的形式存在,因此,作者考慮將白藜蘆醇苷轉化成白藜蘆醇苷元,這將大大提高白藜蘆醇的得率。（虎杖提取用乙醇）同樣酶解技術可以用于提取黃酮類，皂苷類，苯丙素類，有機酸類，蛋白質類，揮發(fā)油。第46頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.采用纖維素酶解法新工藝提取虎杖中白藜蘆醇。即在乙醇提取前,先用纖維素酶處理虎杖粗粉。通過實驗確定最佳的提取工藝條件為:提取溫度50℃,酶解pH值5.0,酶解時間90min,纖維素酶與虎杖粗粉配比為1∶500。與傳統(tǒng)醇提工藝相比,提取率提高了近5倍。第47頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2.人參的有效成分為皂苷類，其中在紅參與野山參中僅為十萬分之幾的人參皂苷Rh2等稀有成分，對腫瘤細胞具有凋亡等作用，對人體無毒且具有較高的保健功能。但人參皂苷Rh2結構復雜，以化學方法制備的難度高、污染大、收率低。金鳳燮采用皂苷酶處理人參中常見組分Rb、Rc、Rd等二醇類皂苷生產Rh2等稀有皂苷。酶處理生產Rh2等的轉化率在60％以上，比從紅參中直接提取提高了500～700倍。第48頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、酶解技術在中藥提取液精制與純化的應用

中藥水提液含有多種類型的雜質，如淀粉、蛋白質、鞣質、果膠等。采用常規(guī)提取法時，煎煮過程中藥材里的蛋白質遇熱凝固、淀粉糊化，影響有效成分煎出，分離困難。針對中藥水提液中所含的雜質類型，采用相應酶將其降解為小分子物質或分解除去，可解決上述問題，并改善中藥口服液、藥酒等液體制劑的澄清度，提高成品質量。第49頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月例：采用木瓜蛋白酶對中藥材(茯苓、牡丹皮)煮出液中的蛋白質進行降解。結果表明，在pH5.5、45℃的最佳酶解條件下，茯苓和牡丹皮的濁度分別降低了14％和25％。第50頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月展望通過酶工程技術可在溫和條件下對藥效成分進行高選擇性轉化，不僅能克服工業(yè)常用提取方法中提取率低、工序復雜等問題，還能提高提取體系的澄清度、改變藥材質地，同時可以在提取中改變原有天然成分結構，增加提取物的生理活性。且耗能低，降低生產成本，減少環(huán)境污染。因此，酶工程技術對中藥有效成分的提取具有潛在的工業(yè)應用價值。第51頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月今后研究的主要方向應集中在：一、酶在中藥提取過程中，對中藥提取效率及生成產物的控制；二、一些重要中藥化學成分的酶轉化及合成；三、建立酶提取中藥產物藥理活性的快速篩選；四、酶反應產物結構的快速測定；五，特殊活性酶的篩選。總之，酶技術應用為開展中藥生產和研究提供了新的機會和方法，應該加強酶技術在中藥基礎和應用上的研究。

第52頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月存在問題酶法提取對實驗條件要求較高，為使其發(fā)揮最大作用，需先經實驗確定最適反應條件，如溫度、pH及作用時間等。還需綜合考慮酶及底物濃度、抑制劑和激動劑等對提取物的影響。

酶反應個別目標成分的變化。酶與非目標產物的殘留酶制劑的標準第53頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月國際酶學委員會，根據(jù)各種酶所催化反應的類型，把酶分為6大類，即氧化還原酶類，轉移酶類，水解酶類，聚合酶類，異構酶類和連接酶類。此外，DNA合成技術的迅速發(fā)展為酶的遺傳設計開創(chuàng)了令人鼓舞的美好前景。只要有遺傳設計藍圖，就能人工合成酶基因，從而合成某一類酶。酶遺傳設計的主要目的是創(chuàng)造優(yōu)質酶，用于生產昂貴特殊的藥品以滿足人們的特殊需要。酶的分類

第54頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)pH值對酶活性的影響酶的活性受環(huán)境pH的影響極為顯著，通常各種酶只有在一定的pH范圍內才能表現(xiàn)出它的活性。一種酶表現(xiàn)其最高活性時的pH值稱為該酶的最適pH。高于或低于最適pH值時，酶的活性降低。酶的最適pH值受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖液的種類和濃度以及環(huán)境溫度等條件影響。

(二)溫度對酶活性的影響每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。一般而言，若酶處于過高的溫度環(huán)境中，會使酶活性永久地喪失；而若處于極低溫度的環(huán)境中只會使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會全部或部分地恢復其活性。第55頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)酶濃度對酶促反應速度的影響在其它條件不變的情況下，若反應物濃度大大高于酶濃度時，則反應速度隨酶濃度增加而增加，兩者間成正比關系，即：V=k[E]

但若反應底物濃度較低，而且酶的濃度足夠高時，增加酶濃度，反應速度基本不變。

(四)離子對酶活性的影響就唾液淀粉酶而言，低濃度Cl一可以增加酶活性，高濃度的Cl一或者低濃度的Cu2+則會抑制酶的活性，而低濃度的Na+、SO42-等對酶活性沒有影響。不同的酶對不同的離子具有不同的效應。第56頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的定義

酶是由生物細胞產生的，受多種因素調節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。與一般催化劑相比有其共同性，但又有顯著的特點，酶的催化效率高，具有高度的專一性，酶的活性受多種因素調節(jié)控制，酶作用條件溫和，但不夠穩(wěn)定。第57頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的分類

國際酶學委員會，根據(jù)各種酶所催化反應的類型，把酶分為6大類，即氧化還原酶類，轉移酶類，水解酶類，聚合酶類，異構酶類和連接酶類。此外，DNA合成技術的迅速發(fā)展為酶的遺傳設計開創(chuàng)了令人鼓舞的美好前景。只要有遺傳設計藍圖，就能人工合成酶基因，從而合成某一類酶。酶遺傳設計的主要目的是創(chuàng)造優(yōu)質酶，用于生產昂貴特殊的藥品以滿足人們的特殊需要。第58頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的最佳溫度及最佳pH值往往在一個很小的范圍內，為使酶的活性提高到最大值，必須嚴格控制酶反應時的溫度及pH值，反應條件的微小波動，都可能是酶的活性大大降低，因此對實驗設備有較高的要求。酶法提取過程中，有可能改變中藥中某些成分，產生