數(shù)字PCR檢測(cè)外周血T790M的運(yùn)用婁加陶上海市胸科醫(yī)院肺癌治療策略的變革PreciseTherapyClinicalPathologyMolecularOnocologyMolecularDiagnosticsOnocologyDiseaseGuidedOnocologyPathologyGuidedLess

choices：SurgeryIncreasedtherapeuticoptionsThemutations

ofdriver

genes

astargetsRadiotherapyaccording

todifferent

tumortypesChemotherapyPresented

ByEnriqueta

Felipat2015

ELCC;臨床的問(wèn)題和需求再活檢和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)困難沒(méi)有足夠的腫瘤組織腫瘤異質(zhì)性（時(shí)間和空間）侵襲性→非侵襲性→靜態(tài)

動(dòng)態(tài)→單基因

多基因靶向耐藥不可避免T790M突變是主要的耐藥機(jī)制Yu

H

Aet

al.ClinCancerRes2013;19:2240-2247T790M組織檢測(cè)的空間異質(zhì)性30位TKI耐藥后接受多位點(diǎn)再次活檢患者的T790M狀態(tài)BiopsySite1T790M

BiopsyT790MPatients◆/

◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆

◆◆

Site2◆/

◆◆

◆

◆◆

Patient

1Patient

2Patient

3Patient

4Patient

5Patient

6Patient

7Patient

8LungtumorLungtumorLungtumorBraintumorBraintumorCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSF其中22例匹配的胸部和腦部標(biāo)本Pleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionLungtumor胸部總計(jì)腦部+2-+-02Patient

9Patient

10Patient

11Patient

12Patient

13Patient

14Patient

15Patient

16Patient

17Patient

18Patient

19Patient

20Patient

21Patient

22Patient

23Patient

24Patient

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26Patient

27Patient

28Patient

29Patient

30101210

2010

22總計(jì)LungtumorLungtumorLungtumor一致性

:12/22（55%）Pleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionClavicularLNLungtumorLung(primary)LungtumorLungtumorCSFCSFCSFCSFAkitoHata,et

al.JTO,

2015CSFPleural

effusionLung(meta)Pleural

effusionPleural

effusionSkintumorPleural

effusionClavicularLNPericardialeffusionAbdominalLNLungtumorLungtumorLungtumorT790M組織檢測(cè)的時(shí)間異質(zhì)性24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均檢測(cè)T790M突變狀態(tài)5位患者停止

TKI

治

療一段時(shí)間后，T790M

狀

態(tài)從陽(yáng)性變成陰性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的必要性！1位患者在接受高劑量的厄洛替尼后腦脊液的T790M

由

陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性?

×

?:代表接受TKI治療；?：代表停止TKI治療A

：阿法替尼；III

：三代TKI；B

：貝伐單抗；H-E：高劑量erlotinib；G：易瑞沙AkitoHata,et

al.JTO,

2015耐藥T790M突變檢測(cè)挑戰(zhàn)？

373例初治的患者，298例患者存在T790M突變，比例高達(dá)約80%

突變豐度<1%的患者比例為98%，突變豐度>1%的患者比例僅為2%；高靈敏度檢測(cè)方法的必要性！Masaru

etal,ClinCancer

Res(2015)二、如何做？1、樣本來(lái)源多種樣本的獲取方式和優(yōu)缺點(diǎn)1.

組織活檢（腫瘤蠟片）2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)本（惡性胸水）3.血液標(biāo)本（ctDNA)樣本品質(zhì)和腫瘤細(xì)胞含量可能比組織樣本較低當(dāng)無(wú)法獲取組織或細(xì)胞學(xué)樣本時(shí)，作為有效補(bǔ)充過(guò)往的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)DNA

片段/假陰性較多，需要高敏感度方法-+-+-侵入性每個(gè)病人都適用++--動(dòng)態(tài)檢測(cè)對(duì)于組織和胸水都取不到的患者，血液樣本是一個(gè)很好的補(bǔ)充Pirker

Retal.JThorac

Oncol2010;

Savic

Setal.BrJCancer

2008;

Rekhtman

Netal.JThoracOncol2011;Tanaka

Tetal.CancerSci2007組織/細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是目前的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍有局限部分患者無(wú)組織標(biāo)本或無(wú)足夠的組織標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)由于腫瘤異質(zhì)性，重復(fù)活檢和動(dòng)態(tài)檢測(cè)困難僅根據(jù)初診時(shí)標(biāo)本指導(dǎo)后續(xù)治療可能產(chǎn)生偏倚1.

Pirker

Ret

al.

JThoracOncol2010;5:1706–1713;2.

MarchettiAand

Normanno

N.Patholgica

2010;102:119–122;3.

Eberhard

Detal.

JClinOncol2008;26:983–994;4.

KimuraHet

al.

BrJCancer

2006;95:95:1390–1395;5.

OshitaFetal.

BrJCancer

2006;95:1070–1075;血液檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)指導(dǎo)用藥勻質(zhì)標(biāo)本實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)作為無(wú)法獲取組織標(biāo)本的補(bǔ)充，無(wú)創(chuàng)取樣后的檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥循環(huán)而勻質(zhì)的血液標(biāo)本，在一定程度有效克服異質(zhì)性實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，提高全程管理水平1.

Molina-VilaMetal.

JThoracOncol2008;3:1224–1235;2.Smouse

Jetal.

Cancer

Cytopathol2009;117:67–72;3.

VanEjikRet

al.

PLoSOne2011;6:e177791;4.

Rekhtman

Net

al.

JThoracOncol

2011;6:451–458EGFR基因突變血液檢測(cè)共識(shí)2014年歐洲藥品管理局：當(dāng)難以獲取腫瘤組織樣本時(shí)，可采集外周血作為補(bǔ)充標(biāo)本評(píng)估EGFR基因突變，以明確吉非替尼治療中受益的患者2015年《NSCLC血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》：腫瘤組織仍是優(yōu)先選擇的生物樣本，但難以獲取時(shí)血液可作為合適的替代生物材料《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》.中華醫(yī)學(xué)雜志,

2015.二、如何做？2、檢測(cè)平臺(tái)血液EGFR檢測(cè)方法技術(shù)手段ARMS第二代ARMS

（superARMS）Nestedreal-timePCRDropletDigitalPCRMicrofluidicDigitalPCRCOLD-ddPCRNanofluidicDigitalPCRBEAMingDigitalPCRcastPCR（Competitive

AlleleSpecific

TaqMan

PCR）Clamping

PCRSynchronous

TES（thermal-electrophoreticseparation）NGSInt.

J.

Mol.Sci.2015,

16,14122-14142ARMS,

digital

PCR,NGS的比較ARMSDigital

PCRNGS單一基因/已知突變位點(diǎn)單一基因/知突變位點(diǎn)已

多個(gè)基因/測(cè)序長(zhǎng)短可知或未知突變位點(diǎn)<5%(依照檢檢測(cè)靈敏度下限數(shù)據(jù)能否量化試驗(yàn)操作難度數(shù)據(jù)解讀難度報(bào)告準(zhǔn)備時(shí)間是否已批準(zhǔn)上市1-5%<0.1%可量化++測(cè)序列不同而異)半定量標(biāo)準(zhǔn)基線校正)(需有可量化+++++++++(專業(yè)實(shí)力差距大)2-3周2-3天+3-4天伴隨診斷VVVV動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)V(需有標(biāo)準(zhǔn)基線校正)V臨床應(yīng)用新靶點(diǎn)探尋耐藥機(jī)制探尋病人生物標(biāo)記物VV單一靶點(diǎn)單一靶點(diǎn)多靶點(diǎn)ARMS-PCR儀器平臺(tái)------適用多種主流的熒光定量PCR儀器試劑盒----

組織血液均獲批，適用樣本類型多（新鮮組織，石蠟組織，胸水，血液）靈敏度：對(duì)同一份突變含量低至1%的DNA樣品進(jìn)行10次重復(fù)，均能檢出試劑盒名稱是否獲批用途及特點(diǎn)組織CFDA和CE認(rèn)證ADx-EGFR

mutationCFDA和CE認(rèn)證ADx-EGFR

mutationin

ctDNA血液ADx-SuperARMS尚未獲批單點(diǎn)T790M檢測(cè)DropletDigitalPCR整體原理：“分而治之”（divide

and

conquer），靈敏度高，適合稀有DNA片段檢測(cè)DilutionDistribution

Amplification

QuantificationNGSctDNA提取及質(zhì)量檢測(cè)文庫(kù)制備及質(zhì)量控制測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析NGS和ddPCR都能夠報(bào)告等位基因突變頻率，反映不同亞克隆的比例關(guān)系NGS和ddPCR都是通過(guò)計(jì)算，看檢測(cè)出多少帶有突變的DNA（突變型），和檢測(cè)到的所有的DNA（野生型+突變型）的比值來(lái)確定等位基因突變頻率（AF）。?

等位基因突變頻率=4/14=28.5%?

未突變的DNA來(lái)自正常組織或腫瘤中的其他亞克隆EGFR

L858通過(guò)等位基因突變頻率在結(jié)合樣本病理評(píng)估中的腫瘤細(xì)胞占比，我們能夠?qū)δ[瘤內(nèi)部帶有不同驅(qū)動(dòng)基因的腫瘤細(xì)胞亞克隆有一個(gè)大致的比例上的了解。對(duì)了解腫瘤異質(zhì)性有幫助。NGS能夠覆蓋傳統(tǒng)方法和ddPCR無(wú)法檢測(cè)的突變種類?

MET14exon

skipping，HER2

20exon

insertion等情況復(fù)雜的突變?

EGFR等熱點(diǎn)基因的非熱點(diǎn)突變位點(diǎn)?

ALK等熱點(diǎn)基因的非常見(jiàn)融合方式?

罕見(jiàn)的EGFR-19Del

可能會(huì)造成PCR方法假陰性約3/4

ALK融合為經(jīng)典的EML4-ALK融合，但有1/4為與其他基因的融合，包括：?

STRN-ALK?

CATSPERB-ALK?

ACVR1-ALK?

CLIP1-ALK?

DPH6-AS1-ALK?

KIF5B-ALK?

RP11-320M2.1-ALK?

UGP2-ALK二、如何做的準(zhǔn)？自建系統(tǒng)性能確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室自建分子診斷項(xiàng)目的基本要求(2016)準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及環(huán)境精確性監(jiān)管實(shí)驗(yàn)室人員要求實(shí)驗(yàn)室管理要求參考范圍可報(bào)告范圍分析靈敏度性能確認(rèn)性能確認(rèn)質(zhì)量控制試劑耗材質(zhì)量室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)分析特異性臨床驗(yàn)證中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)師分會(huì)分子診斷專家委員會(huì)：《實(shí)驗(yàn)室自建分子診斷項(xiàng)目基本要求專家共識(shí)》血液EGFR基因突變檢測(cè)流程微滴閱讀結(jié)果分析生成微滴PCR擴(kuò)增血漿分離（兩次離心）4℃

1600g

10min4℃

16000g

10minQX200?

Droplet

Digital?

PCR

系統(tǒng)樣本檢測(cè)核酸抽提QIAampCirculatingNucleic

AcidKit（55114）PCR反應(yīng)體系配置ddPCRTM

Supermixfor

Probes;PrimePCRTMddPCRTM

MutationAssayQCQuibit

3.0分析前質(zhì)量控制-樣本處理方法：選擇早期和晚期臨床肺癌患者各3例，2h內(nèi)分離血漿，每個(gè)病人血漿均分成2mL的4等份，以4個(gè)不同公司的試劑盒進(jìn)行血漿游離DNA抽提，qubit比較其濃度，2100檢測(cè)相應(yīng)的純度。公司A公司BctDNA濃度比較公司A公司B10008006004002000公司C公司D公司C公司D不同臨床分期的血漿樣本早3血漿抽提2100檢測(cè)cfDNA條帶分布空白檢測(cè)限(LOB)方法：對(duì)20名健康人外周血3個(gè)EGFR基因位點(diǎn)（19del、T790M、L858R）突變情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果突變微滴數(shù)目均在0-1之間，利用檢測(cè)結(jié)果繪制泊松分布圖，并以其95%置信區(qū)間上限作為參考上限，設(shè)定空白檢出限。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：

ch1+ch2-

微滴數(shù)≥21

.00

.80

.60

.40

.20

.019-Del1

.00

.80

.60

.40

.20

.0L858RT790MLOB=11

.00

.80

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.40

.20

.0LOB=1LOB=1024681

01

2024681

01

2024681

01

2F

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tsIn

Submission準(zhǔn)確性64例晚期非小細(xì)胞肺癌血漿樣本與ddPCR結(jié)果與NGS比較：一致性良好。NGSConcordanddPCRKappay=0.3827x+0.0106R2=0.8894+—ce（%）0

.30

.20

.10

.0+—+111250119-DelsL858RT790M95.310.8510.9130.93814196.8898.44—+4800

.20

.40

.60

.89d

d

P

CR—154Guo

qiaomei,

etal,Oncotarget,insubmission精密度方法：選取高低2個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品（突變比例分別為1%、0.1%），每天測(cè)定3次，連續(xù)5天進(jìn)行精密度評(píng)估，精密度小于15%視為符合要求。1%標(biāo)準(zhǔn)品0.1%標(biāo)準(zhǔn)品19-Dels5.91%L858RT790M19-DelsL858RT790M3.52%8.60%9.80%8.61%14.63%批內(nèi)精密度（%）批間精密度（%）12.34%12.44%12.33%14.12%14.74%8.65%線性范圍方法：以野生型A549細(xì)胞系DNA對(duì)突變型細(xì)胞系DNA進(jìn)行稀釋，制備突變比例為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)模板，得到的結(jié)果以預(yù)期結(jié)果作橫坐標(biāo)，以實(shí)際觀測(cè)結(jié)果為縱坐標(biāo)，做線性評(píng)估，回歸系數(shù)R2>0.99可判斷為線性。1

9

-D

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8

5

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RT

7

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=

0.9566*X

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0.0004336Y

=

1.016*X-

0.00016031110

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)Guo

qiaomei,

etal,Oncotarget,insubmission分析靈敏度方法：將1%突變比例的標(biāo)準(zhǔn)品采用野生型標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度，每個(gè)位點(diǎn)每種突變比例下設(shè)置20個(gè)反應(yīng)。要求CV%<20%。（nX

-

X

）i24

03

02

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5

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RT790Mi

1n

-

1CV（%）=α/Xmean

×100%CV(%)19-DelL858RT790M1%0.5%13.2114.6412.160.1%16.4314.5213.020.05%19.1214.5636.197.37.9910.50

.0

0

.1

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1

.0m

u

ta

n

t(%

)InSubmission分析特異度突變比例（突變型/野生型）DNA模

板19-Del0/1780T790M0/1840L858R高濃度野生型基因組DNA中濃度野生型基因組DNA0/19000/79600/74000/7720低濃度野生型基因組DNA0/137800/138000/14420-L858R

/T790M陽(yáng)性細(xì)胞系0/11720--DNA19-Dels

陽(yáng)性細(xì)胞系DNA