十三.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用淋巴瘤免疫分型目前淋巴瘤的分類(lèi)方法已從LSG的形態(tài)學(xué)分類(lèi)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镽EAL分類(lèi)法，REAL分類(lèi)法是以腫瘤發(fā)生源為基礎(chǔ)的分類(lèi)方法，在原來(lái)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上加上免疫學(xué)分型后再加以分類(lèi)，這種分類(lèi)方法不僅能夠推斷腫瘤的發(fā)生源，對(duì)治療也有指導(dǎo)意義。因此淋巴瘤的免疫分型越來(lái)越重要。如同白血病免疫分型一樣，淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原,分析其表現(xiàn)型，以了解被測(cè)淋巴瘤細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。流式細(xì)胞儀能對(duì)多數(shù)的淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原迅速客觀地做出檢測(cè)，在淋巴瘤的免疫分型中起著不可替代的作用。臨床淋巴瘤的免疫分型的檢測(cè)標(biāo)本一般是淋巴結(jié)、脾臟、胸水、腹水等。在臨床淋巴瘤的免疫分型工作中?？捎龅揭韵滤姆N情況：①B細(xì)胞系淋巴瘤②T/NK細(xì)胞系淋巴瘤③淋巴細(xì)胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤④造血細(xì)胞以外的腫瘤。REAL分類(lèi)淋巴瘤的免疫表型見(jiàn)表12.8。表1L8REAL分美ifr巴宿的免疫表型—CQCQCQCDCQCQCQ10CDlieCQ16CQ19CQ50CDCDCQ30CQCQ56ELEL十明LLT-—LPL*/-十HCL十-t-PEL十-9-AIZL-9-SMZL:*AHCL—十PCDLPL+一BL一-?-一HBLB-t-癡TLEL十十十-?-十TPLLLGLT-t--t-—LCLNE-t-十-t-十AiF-t-—十PTL十AELDACLITCL4AIL-t-LCL*LCLH*/-+* :弱表達(dá)或陰性。BLBL:前B原始淋巴細(xì)胞淋巴瘤/白血?。籅SLL:B-小淋巴細(xì)胞淋巴瘤；LPL:淋巴漿細(xì)胞樣淋巴瘤；MCL:斗篷細(xì)胞淋巴瘤；FCL:濾泡中心淋巴瘤；MZL:邊緣帶B細(xì)胞淋巴瘤；SMZL:脾MZL;HCL:毛細(xì)胞白血??；PC:漿細(xì)胞瘤；DLBL:B-彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤；BL:Burkitts淋巴瘤；HBLB:高度B細(xì)胞淋巴瘤，Burkitts樣;TLBL:前T原始淋巴細(xì)胞淋巴瘤/白血?。籘PLL:T幼淋細(xì)胞白血??；LGLT:大顆粒淋巴細(xì)胞白血病，T細(xì)胞型；LGLNK:大顆粒淋巴細(xì)胞白血病，NK細(xì)胞型；MF:覃樣真菌?。籔TL:外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特異;AILD:血管免疫T細(xì)胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤；ITCL:腸T細(xì)胞淋巴瘤；ATL:成人T細(xì)胞淋巴瘤/白血??；LCL:大細(xì)胞淋巴瘤；LCLH:大細(xì)胞淋巴瘤，何杰金氏樣；B細(xì)胞系淋巴瘤大多數(shù)情況下，B細(xì)胞系淋巴瘤CD19、CD20陽(yáng)性，分化早期CD20陰性，CD10、CD34陽(yáng)性；分化晚期CD5、CD23陽(yáng)性，成熟為漿細(xì)胞后以上標(biāo)記均陰性。利用單克隆抗體K、入(正常時(shí)K：入=2：1)可檢測(cè)免疫球蛋白輕鏈的偏移，推斷是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6.列出了外周B淋巴系淋巴瘤的4種類(lèi)型的免疫分型。SLL(smallcelllymphocytelymphoma)--小細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤：小細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞一般表達(dá)CD19、CD20、CD43和CD79,CD5與以上抗原復(fù)合表達(dá)，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表達(dá)但表達(dá)較弱，CD10、CD22陰性。伴染色體異常者預(yù)后較差。MCL(mantlecelllymphoma)--斗篷細(xì)胞淋巴瘤：MCL包括以前分類(lèi)為中等淋巴細(xì)胞淋巴瘤(ILL)、中度分化淋巴細(xì)胞淋巴瘤(IDL)、中心細(xì)胞淋巴瘤和套區(qū)細(xì)胞淋巴瘤(MZL)，占淋巴瘤的2%-8%，入型較k型常見(jiàn)，sIgM中度表達(dá),IgD弱或陰性，表達(dá)CD19、CD20、CD22、CD43，但多數(shù)病例CD5陽(yáng)性CD23陰性，CD10一般陰性，CD5陽(yáng)性CD23陰性和Ig類(lèi)型可幫助鑒別MCL和FCL。FCL(Follicularcentercelllymphoma)---瀘泡中心細(xì)胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表達(dá)CD19、CD20、CD22，sIg強(qiáng)表達(dá)，但多數(shù)病例CD10和CD23陽(yáng)性，典型FCCLCD5、CD43和CD11c陰性。CD10陽(yáng)性、CD11c陰性和sIg強(qiáng)表達(dá)利于與MZL鑒別。MZL(Marginalzonelymphoma)--邊緣帶淋巴瘤和相關(guān)B細(xì)胞淋巴瘤：典型免疫表型：CD19、CD20、CD22、HLA-DR陽(yáng)性，sIg中度表達(dá)，CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數(shù)情況下陰性，多數(shù)表達(dá)CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數(shù)情況下陰性，利于與CLL/SLL、FCCL、MZL鑒別。T/NK細(xì)胞系淋巴瘤早期T細(xì)胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3陽(yáng)性。T/NK細(xì)胞系淋巴瘤的詳細(xì)分類(lèi)及表型參見(jiàn)表12.8。細(xì)胞膜CD3陽(yáng)性可確認(rèn)為外周T細(xì)胞腫瘤，外周T細(xì)胞腫瘤的特征是CD3與CD4或CD8復(fù)合表達(dá)，并常有克隆性T細(xì)胞受體，或a-p型或y-6型；MF(mycosisfungoides)--蕈樣真菌病和sezary綜合癥:占皮膚淋巴瘤的絕大多數(shù)，CD4陽(yáng)性，同時(shí)表達(dá)CD2、CD3、CD5,有時(shí)CD7陰性，CD8陽(yáng)性病例極少見(jiàn)但已有報(bào)道，有無(wú)TCRp基因重排對(duì)鑒別淋巴瘤和炎性反應(yīng)有幫助。LCL(largecelllymphoma)--大細(xì)胞淋巴瘤：大細(xì)胞淋巴瘤(LCL)占成人淋巴瘤的40%，兒童的1/3，成人80%是B細(xì)胞型的，兒童B細(xì)胞型和T細(xì)胞型各占一半。淋巴細(xì)胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤急性髓系細(xì)胞白血病(特別是M4、M5)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)有發(fā)生，如T、B淋巴細(xì)胞標(biāo)記低表達(dá)應(yīng)懷疑并按白血病免疫分型處理。造血細(xì)胞以外的腫瘤檢測(cè)淋巴結(jié)、胸腹水標(biāo)本時(shí)如遇CD45陰性情況應(yīng)考慮非造血系統(tǒng)腫瘤淋巴結(jié)、胸膜、腹膜轉(zhuǎn)移。十四.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用紅細(xì)胞疾病診斷(一)網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定計(jì)數(shù)外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量，對(duì)于評(píng)價(jià)骨髓紅系造血及網(wǎng)織紅細(xì)胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)送速率有重要意義。有核紅細(xì)胞在成熟過(guò)程中，脫去細(xì)胞核后仍有少量RNA殘留在細(xì)胞漿內(nèi)，再經(jīng)過(guò)約一天時(shí)間殘留RNA完全消失，成為成熟紅細(xì)胞。這種細(xì)胞漿內(nèi)有殘留RNA的紅細(xì)胞稱(chēng)作網(wǎng)織紅細(xì)胞。正常情況下有一定量的網(wǎng)織紅細(xì)胞出現(xiàn)在外周血中，正常值為1.0?1.5%，上限3.0%，但當(dāng)紅細(xì)胞數(shù)異常時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。因此用網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值表示,正常值5?15x1010/L。由于常規(guī)方法測(cè)定須先在體外經(jīng)活體染色(最常用亞甲蘭)，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)有限。用流式細(xì)胞儀測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn):①可避免由于細(xì)胞核的碎片或鐵幼粒細(xì)胞的顆粒的存在而出現(xiàn)假性網(wǎng)織紅細(xì)胞升高②可避免人為誤差③因?yàn)榭稍诙虝r(shí)間內(nèi)測(cè)量上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,結(jié)果較常規(guī)方法準(zhǔn)確、可靠，④同時(shí)可給出網(wǎng)織紅細(xì)胞年齡結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞方法簡(jiǎn)單，只須將紅細(xì)胞洗凈后用熒光染料染色后即可上機(jī)檢測(cè)。常用的熒光染料有焦寧Y(PyroninY)丫啶橙(AcridineOrangeAO)碘化丙啶(崛PropidiumIodinePI)花青(Cyaninedye)等。(二)PNH診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)因血細(xì)胞膜上錨固蛋白-糖磷酸肌醇(GPI)減少或缺乏而導(dǎo)致與GPI有關(guān)的補(bǔ)體激活抑制因子如CD55、CD59減少或缺乏，因而紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體異常敏感發(fā)生溶血。流式細(xì)胞儀檢查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59雙陽(yáng)性細(xì)胞〉95%,PNH病人CD55、CD59明顯減少，這種減少不僅表現(xiàn)在紅細(xì)胞上，粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也有減少。已發(fā)現(xiàn)CD55c可能對(duì)GPI減少或缺乏較CD59更敏感。十五.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中應(yīng)用血小板功能分析和血小板病診斷血小板功能分析血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期血小板的膜糖蛋白受體的種類(lèi)、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同，用不同的抗血小板單克隆抗體可測(cè)定和分析血小板功能狀態(tài)。血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b(GPIb)、CD41b(GPIIb)、血小板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測(cè)定可供分析血小板功能狀態(tài)，如CD62p、CD63正常血小板不表達(dá)，當(dāng)血小板活化時(shí)表達(dá)明顯增加，可用來(lái)測(cè)定活化血小板。血小板病診斷攪1.血小板相關(guān)抗體測(cè)定血小板相關(guān)抗體可因不同機(jī)制產(chǎn)生。抗血小板自身抗體(包括原發(fā)性、藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生、合并其它自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)能引起嚴(yán)重的血小板減少。大多數(shù)原發(fā)性(免疫性)血小板減少性紫瘢病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相關(guān)抗體的抗原仍不十分清楚，可能有多種，如GPIb、GPIIb、GPIIIa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗體也可能發(fā)生于多次輸血后或懷孕期間，這些自身抗體多為針對(duì)HLA-I類(lèi)抗原決定簇的抗體，一般是IgG,它們可迅速破壞和清除隨機(jī)供血者的血小板。因此能迅速測(cè)定這些抗體存在與否的方法是必需的。許多不同的利用放免、熒光、酶、SPA等的測(cè)定血小板抗體的方法已建立，但這些方法都很復(fù)雜、費(fèi)時(shí);同時(shí)給出的結(jié)果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗體來(lái)表示。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的用FCM測(cè)定血小板抗體的方法具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可測(cè)定血小板上和血清中的抗體;測(cè)定中FCM分析每一個(gè)血小板表面有無(wú)抗體，能給出血小板群體中有多少血小板表面有抗體(以％表示)；同時(shí)能給出血小板相關(guān)抗體量與血小板數(shù)的直方圖，使我們了解血小板相關(guān)抗體在血小板群體中的分布情況。FCM測(cè)定血小板抗體原理:分別用標(biāo)有熒光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPIb、IIb、IIb/IIIa的抗體與分離洗凈的病人的血小板和在病人血清中孵育過(guò)的正常O型血小板作用后用FCM測(cè)定，前者測(cè)定的是病人血小板上的抗體后者測(cè)定的是病人血清中的抗體。血小板無(wú)力癥血小板無(wú)力癥時(shí)血小板膜GPIIb/IIIa明顯減少，用血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41、CD61和流式細(xì)胞儀測(cè)定不僅可測(cè)出GPIIb/IIIa減少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，還可測(cè)出GPIIb/IIIa減少程度，分類(lèi)血小板無(wú)力癥。巨大血小板綜合征(BSS):血小板巨大,CD42a減少，CD42b減少，CD61增加。十六.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用微小殘留白血病檢測(cè)微小殘留白血病(MinimalResidualLeukemiaMRL)是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解(CompleteRemissonCR)后體內(nèi)殘留少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。微小殘留白血病與明顯白血病(Overtleukemia)無(wú)明確界限，僅是白血病細(xì)胞負(fù)荷數(shù)量不同，一般成人明顯白血病時(shí)白血病細(xì)胞可達(dá)1012,經(jīng)治療獲CR后＜1010,因此MRL狀態(tài)白血病細(xì)胞數(shù)可能是100-10攪。MRL是白血病復(fù)發(fā)的根源，因此檢測(cè)MRL有十分重要的意義：①指導(dǎo)臨床治療②預(yù)測(cè)白血病復(fù)發(fā)③評(píng)價(jià)自體骨髓移植的凈化效果。應(yīng)用FCM檢測(cè)MRL的優(yōu)點(diǎn)在于可在短時(shí)間內(nèi)分析大量標(biāo)本，具有快速的特點(diǎn)。由于白血病細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)記,FCM檢測(cè)MRL的效果尚不理想，敏感性尚不夠高，一般僅有1/103-104。目前主要有兩類(lèi)檢測(cè)方法:①用FCM分析CR期骨髓細(xì)胞核酸量或染色體，可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性?xún)H1-5%。②免疫表型分析，由于尚無(wú)白血病特異的標(biāo)記,只能通過(guò)與正常細(xì)胞比較某些抗原量的差別及分布部位的不同作為檢測(cè)依據(jù);如利用TdT和CD10雙標(biāo)記檢測(cè)MRL,但敏感性亦不高，約0.1-1%。假陰性結(jié)果可能由于：①標(biāo)本中的白血病細(xì)胞＜10-4攪或＜10-5;②所取標(biāo)本不能代表全身骨髓情況；③病人白血病細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。十七.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用白細(xì)胞吞噬功能測(cè)定粒、單核-巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞中的重要成員。它們不僅具有吞噬功能，吞噬外來(lái)的微生物、腫瘤細(xì)胞等，同時(shí)又分泌多種生物因子參于免疫反應(yīng)，此外單核-巨噬細(xì)胞對(duì)抗原物質(zhì)的攝取、修飾、遞呈等作用，是淋巴細(xì)胞的免疫功能必不可少的。因此檢測(cè)白細(xì)胞吞噬功能對(duì)了解機(jī)體免疫狀況有重要意義。以下簡(jiǎn)要介紹FCM測(cè)定白細(xì)胞吞噬功能的概況。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡測(cè)定白細(xì)胞吞噬功能時(shí)須分離粒、單核細(xì)胞，并盡可能地保持細(xì)胞活性。用FCM檢測(cè)時(shí)不須分離細(xì)胞，應(yīng)用全血即可，因此可在自然狀態(tài)下測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。目標(biāo)粒子一般以酵母、細(xì)菌等能激發(fā)自然吞噬作用或予先以抗體調(diào)理化的人造粒子為好；并標(biāo)以熒光，常用者為FITC(異硫氤酸熒光素)或RA(羅達(dá)明).以肝素或拘櫞酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200pl全血與目標(biāo)粒子200^(目標(biāo)粒子濃度4x107/ml)置37°C溫育,溫育結(jié)束后立即置冰水中，以同樣標(biāo)本不在37°C溫育而置于冰水中者作為對(duì)照。目標(biāo)粒子不同溫育時(shí)間不一,FITC標(biāo)記的金黃色葡萄球菌25分鐘,FITC標(biāo)記的粒子15分鐘即可達(dá)到吞噬飽和;此外，粒子與白細(xì)胞的比例也很重要，一般為10:1。溫育結(jié)束后以溶血?jiǎng)┤苋ゼt細(xì)胞即可上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用FCM全血法測(cè)定白細(xì)胞吞噬功能，對(duì)白細(xì)胞的丟失、損傷最小；此外用本法可測(cè)定血清中的調(diào)理素(Opsonine)水平及血清中有無(wú)吞噬作用抑制因子。如果用FITC標(biāo)記的單克隆抗體CD13、CD14、CD15標(biāo)記粒、單核細(xì)胞,用紅熒光標(biāo)記目標(biāo)粒子，即可測(cè)定吞噬功能與細(xì)胞表面標(biāo)記的關(guān)系,對(duì)白細(xì)胞吞噬功能作進(jìn)一步的研究。十八.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用NK和LAK細(xì)胞活性測(cè)定NK細(xì)胞存在于外周血大顆粒淋巴細(xì)胞中，它對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性不依賴(lài)于抗體，無(wú)MHC限制性，它們的數(shù)量及細(xì)胞毒活性是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要指標(biāo)。人NK細(xì)胞一般表達(dá)CD56、CD16、CD57部分表達(dá)CD2、CD8、CD11而不表達(dá)CD3。LAK(LymphokineActivatedKillercells)細(xì)胞主要存在于LGL的高密度群體中，LAK前體細(xì)胞表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)志CD16而不表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)志如CD3、CD4、CD5等；它們不需要抗原刺激就能殺傷NK細(xì)胞不能殺傷的腫瘤細(xì)胞,并且無(wú)MHC限制性;從表型上看大多數(shù)LAK細(xì)胞來(lái)自NK細(xì)胞，但嚴(yán)格講LAK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性不能稱(chēng)作LAK活性，測(cè)定LAK活性的靶細(xì)胞應(yīng)為NK抵抗的實(shí)體瘤細(xì)胞,如HL-60細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等。常用的測(cè)定NK和LAK細(xì)胞活性的方法較多，如撞51Cr釋放法、[3H]TdR參入法或釋放法、LDH釋放法、ATP發(fā)光法等;應(yīng)用放射性同位素對(duì)人體和環(huán)境不利，利用FCM測(cè)定NK和LAK細(xì)胞活性從1986年就開(kāi)始摸索，方法已趨于成熟,以下介紹其中一種：肝素抗凝取外周血后分離PBMC后洗凈，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml,為效應(yīng)細(xì)胞；靶細(xì)胞分別為K562和HL-60或HeLa細(xì)胞，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期受集細(xì)胞，調(diào)整濃度為106。用3mMDiO(3,3-DiacradecyloxacarbocyaninePerchlorate)標(biāo)記靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞(E:T)為40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10pg/ml)染死細(xì)胞，洗凈后即可上機(jī)檢測(cè)。DiO發(fā)綠熒光,PI發(fā)紅熒光，利用雙參數(shù)(FL1vFL2)直方圖可清楚地了解靶細(xì)胞中的死亡細(xì)胞，計(jì)算出靶細(xì)胞％溶解率。十九.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的 應(yīng)用造血干/祖細(xì)胞測(cè)定造血干/祖細(xì)胞移植已廣泛應(yīng)用于血液腫瘤、實(shí)體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等，因此檢測(cè)造血干/祖細(xì)胞已成為臨床必不可少的手段。應(yīng)用流式細(xì)胞儀多色技術(shù)測(cè)定外周血造血干/祖細(xì)胞，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，不僅能確定造血細(xì)胞數(shù)量，而且能對(duì)造血干祖細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床干細(xì)胞移植治療提供重要數(shù)據(jù)。目前多色組合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。CD34抗原是一種分子量約11萬(wàn)的糖蛋白，選擇性地表達(dá)于早期造血干/祖細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞和胚胎纖維母細(xì)胞表面。該抗原在原始造血細(xì)胞上表達(dá)，以后隨細(xì)胞分化、成熟逐漸減少直至消失，因此一直作為造血干/祖細(xì)胞表面的一種特征性標(biāo)志而廣泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床。CD34+細(xì)胞是一群不均一的群體，依其是否表達(dá)CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亞群表現(xiàn)出了不同的造血性能。最近隨著造血理論的深入研究關(guān)于造血干細(xì)胞究竟是否都是CD34+細(xì)胞出現(xiàn)一些爭(zhēng)論，實(shí)驗(yàn)研究證明，CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞更具造血潛能,有人經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究提出CD34的表達(dá)與造血干細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)相關(guān)，細(xì)胞激活時(shí)CD34+，細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)CD34-;也有人提出CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞發(fā)育階段更早。我們認(rèn)為：成人體內(nèi)可能仍保留著一小部分原始間充質(zhì)細(xì)胞，他們?nèi)员Ａ糁嘞蚍只芰Γ材芟蛟煅杉?xì)胞分化，因此體內(nèi)有CD34-造血干細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞是正常的，CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞發(fā)育階段更早、更具造血潛能；但目前的用CD34+細(xì)胞代表造血干細(xì)胞的檢查方法已足以滿(mǎn)足臨床需要，因?yàn)榕R床實(shí)踐已證明這一點(diǎn)。理論研究往往能推動(dòng)學(xué)術(shù)發(fā)展，開(kāi)發(fā)新技術(shù)，我們期待著造血理論的不斷發(fā)展給臨床帶來(lái)新技術(shù)，不斷提高臨床療效。我們用CD34、CD38、HLA-DR三色組合測(cè)定了151份外周血經(jīng)動(dòng)員后標(biāo)本，CD34+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞(MNC)的(0.954±0.466)%，含量為(3.55±2.41)x109/L；其中CD34+CD38-亞群含量為(0.253±0.24)x109/L，占CD34+細(xì)胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亞群含量為(0.273±0.310)x109/L，占CD34+細(xì)胞的7.61%；隨著采集次數(shù)的增加，CD34+細(xì)胞及其亞群數(shù)量逐漸減少(PV0.05)；隨著供者年齡增加，其外周血CD34+細(xì)胞數(shù)逐漸減少，在＞40歲供者CD34+細(xì)胞百分比和含量比＜20歲供者分別降低了47%和50%；動(dòng)員后外周血CD34+細(xì)胞數(shù)存在性別差異，男性供者外周血CD34+細(xì)胞數(shù)較女性高23%。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定造血干細(xì)胞雖具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，目前被廣泛采用。但應(yīng)用中要特別重視質(zhì)量控制，要建立一套完整質(zhì)控方法以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。二十.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，因而研究細(xì)胞凋亡有重要意義。細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法很多，應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中發(fā)生一系列形態(tài)、生化變化從多個(gè)角度對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性和定量的測(cè)定。1.細(xì)胞形態(tài)變化：通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞光散射的變化來(lái)觀察細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞前向角光散射的能力顯著降低，90°角光散射的能力增加；在細(xì)胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信號(hào)均降低。此方法特異性不強(qiáng)，目前使用較少。2細(xì)胞膜功能改變：磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserinePS)異位：正常情況下，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)層，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)PS從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并暴露在細(xì)胞膜外層，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。PS與AnnexinV(一種具有強(qiáng)力抗凝作用的血管蛋白)具有高度親和力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀采用FITC-AnnexinV/PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，可同時(shí)描述三群不同狀態(tài)細(xì)胞：FITC-AnnexinV-/PI-細(xì)胞，即正常活力細(xì)胞；FITC-AnnexinV+/PI-細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞；FITC-AnnexinV+/PI+細(xì)胞，即已死亡細(xì)胞。此種方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，指標(biāo)敏感，應(yīng)用者越來(lái)越多。PI/Hoechst33342雙染法：Hoechst33342(HO)是一種DNA的特異性熒光染料，可通過(guò)完整細(xì)胞膜，應(yīng)用PI/Hoechst33342可將細(xì)胞分為三群：正?；罴?xì)胞(HO強(qiáng)/PI-)，凋亡細(xì)胞(HO弱/PI-)，(由于凋亡細(xì)胞發(fā)生DNA降解和丟失，導(dǎo)致HO熒光減弱)，死亡細(xì)胞(HO弱/PI+)。此種方法再結(jié)合凋亡細(xì)胞前向角光散射能力降低的特點(diǎn)，能更好地鑒定凋亡細(xì)胞，但HO須紫外光激發(fā)，由于很多流式細(xì)胞儀不配有紫外激光，故此法應(yīng)用受限。吖啶橙(AO)/漠化乙啶(EB)雙染法:AO是一種異染性熒光染料，可通過(guò)完整的質(zhì)膜，它與核酸的結(jié)合主要是嵌入DNA雙鏈的堿基之間，其發(fā)射峰為530nm，呈綠色熒光。EB的理化特性與PI相似，不能通過(guò)完整質(zhì)膜。應(yīng)用AO/EB雙染法也可以將細(xì)胞分成三群:正常活細(xì)胞(AO強(qiáng)/EB-)，凋亡細(xì)胞(AO弱/EB-)，死亡細(xì)胞(AO弱/EB+)，原理與PI/Hoechst33342雙染法相似，不同的是AO/EB雙染法所的激發(fā)光是被廣泛使用的氬激光(488nm)，而不須紫外光，其缺點(diǎn)是染色過(guò)程較復(fù)雜，且AO易污染設(shè)備管道，因此使用此法者較少。放線(xiàn)菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一種核酸染料，它不能通過(guò)正常質(zhì)膜，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過(guò)程，質(zhì)膜對(duì)7-AAD的通透性逐漸增加，結(jié)合細(xì)胞凋亡中DNA的有控降解，最后通過(guò)7-AAD標(biāo)記DNA的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為三群：7-AAD強(qiáng)為死亡細(xì)胞，7-AAD弱是凋亡細(xì)胞，7-AAD-為正?；盍?xì)胞。此法具有染色快速、簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。另外，由于此法不破壞細(xì)胞膜，故還可聯(lián)合使用FITC、PE標(biāo)記的膜蛋白，對(duì)特殊細(xì)胞群及亞群進(jìn)行多色熒光分析(雖然AO/EB雙染法也不破壞被檢細(xì)胞膜，但由于AO及EB的發(fā)射光波譜分別與FITC和PE的發(fā)射光波譜相似，故AO/EB法不能與FITC和或PE聯(lián)合使用)。此法是應(yīng)用核酸染料測(cè)定細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀法中十分實(shí)用的方法。細(xì)胞器改變：線(xiàn)粒體膜APO2.7蛋白表達(dá)：早期凋亡細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜出現(xiàn)APO2.7蛋白表達(dá)，利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。4.DNA含量變化：主要是PI染色法，由于凋亡細(xì)胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細(xì)胞膜(經(jīng)乙醇及透膜劑處理)漏出細(xì)胞外，使得凋亡細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減低，在流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞DNA含量直方圖中G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即所謂凋亡峰。通過(guò)測(cè)定凋亡峰百分含量，便可知凋亡細(xì)胞比例。此法簡(jiǎn)便、快速，是目前常用的、經(jīng)典的測(cè)量凋亡細(xì)胞的方法。此法存在問(wèn)題：少量的正常的低DNA含量細(xì)胞、由于機(jī)械損傷產(chǎn)生DNA含量減低的壞死細(xì)胞、染色體丟失的分裂相細(xì)胞以及細(xì)胞碎片和微核等都可能出現(xiàn)在亞二倍體峰內(nèi)。因此，此法的特異性較低。5.DNA斷裂點(diǎn)標(biāo)記：細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)生DNA斷裂，利用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)可以將dUTP標(biāo)記到斷裂點(diǎn)上，稱(chēng)作原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)。此法有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種，前者的標(biāo)記物是FITC-dUTP，后者的標(biāo)記物是生物素(biotin)標(biāo)記的dUTP,需要再用FITC標(biāo)記的親和素(avidin)與生物素標(biāo)記的dUTP結(jié)合，使標(biāo)記反應(yīng)倍增，故間接標(biāo)記法靈敏度高，但操作較復(fù)雜。TUNEL還可以配合其它單抗同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞表型分析，或與DNA含量同時(shí)分析。TUNEL法因其靈敏度高而被廣泛采用。6細(xì)胞凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物檢測(cè)：細(xì)胞凋亡是一個(gè)多種基因參與的復(fù)雜過(guò)程,目前已知與bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有關(guān)，這些基因都有相關(guān)產(chǎn)物，目前針對(duì)這些相關(guān)產(chǎn)物已有單克隆抗體生產(chǎn)，應(yīng)用這些單抗，通過(guò)流式細(xì)胞儀可檢測(cè)造血細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平，相互關(guān)系。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡方法、層次眾多，且具有快速、準(zhǔn)確特點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛。在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意采用多種方法結(jié)合使用，使結(jié)果更加可靠準(zhǔn)確。二十一.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀能夠分選某一亞群細(xì)胞，分選純度＞95%。目前細(xì)胞分選主要用于研究，臨床應(yīng)用較少。血液學(xué)應(yīng)用最多的是造血干細(xì)胞的研究，最近隨著造血理論的深入研究關(guān)于造血干細(xì)胞究竟是否都是CD34+細(xì)胞出現(xiàn)一些爭(zhēng)論，實(shí)驗(yàn)研究證明，CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞更具造血潛能，這些實(shí)驗(yàn)研究所用的CD34-和CD34+細(xì)胞就是通過(guò)細(xì)胞分選獲得的。小鼠造血干細(xì)胞分選一般按lin-c-Kit+CD34+/lin-c-Kit+CD34-分選，人造血干細(xì)胞分選一般按lin-CD34+/lin-CD34-分選。為避免某些遺傳性血液病如海洋性貧血、異常血紅蛋白病的純合子出生，產(chǎn)前診斷非常重要，這些疾病的主要靶細(xì)胞是紅細(xì)胞，而孕婦血循環(huán)中存在著胎兒有核紅細(xì)胞，只是數(shù)量非常少，利用流式細(xì)胞儀可從孕婦血液中分選出胎兒有核紅細(xì)胞(分選條件：CD45-GPA+)進(jìn)行基因分析，作出產(chǎn)前診斷。利用流式細(xì)胞儀分選免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)研究也是目前的熱門(mén)課題?？傊魇郊?xì)胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細(xì)胞，只要你想得到的某一亞群細(xì)胞有合適的單克隆抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀的分選功能將得到越來(lái)越多的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。二十二.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用其他流式細(xì)胞儀可能在兩方面對(duì)骨髓增生異常綜合癥(MDS)有用，一是測(cè)定CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以監(jiān)測(cè)病情，二是測(cè)定核蛋白增殖因子(PCNA)，有報(bào)告PCNA再在生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、白血病三種疾病中表達(dá)有明顯差異，可輔助鑒別診斷。此外流式細(xì)胞儀也可檢耐藥蛋白，如肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、多藥耐藥蛋白(MRP)、P170等。流式細(xì)胞儀也可檢測(cè)細(xì)胞因子，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子如白介素系列(IL-1—IL-14)，腫瘤壞死因子(TNF)，干擾素(IFN)等,只要用適當(dāng)?shù)拇蚩讋┘纯捎每股鲜黾?xì)胞因子單克隆抗體標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀測(cè)定。參考文獻(xiàn)CoulterEducationCenter:TrainingGuide(EpicsEliteFlowCytometer),1994,USA.CoulterCorporation:Operater,sGuide(EpicsEliteFlowCytometer),1993,USA.Gray.J.W.Cellcycleanalysisusingflowcytometry.Int.J.Radiat.Biol.1986;49(2):237.Catovsky.D.etal.AClassificationofacuteleukemiafor1990s.AnnHematol1991;62:16.Bemard.A.Thelimitationsinutilizingphenotypicmarkerstodetectminimalresidualdiseasesi