第六節(jié)

蛋白質(zhì)的性質(zhì)及分離分析技術(shù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、兩性性質(zhì)及等電點二、膠體性質(zhì)三、變性與復(fù)性作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用五、沉降作用六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點（pI）。溶液pH＝pI時，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；

pH＞pI時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；

pH＜pI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。

等電點時特點：（1）凈電荷為零（2）一定離子強度的緩沖液：等離子點特征常數(shù)（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點偏酸

堿性AA/酸性AA等電點胃蛋白酶0.21.0

血紅蛋白1.76.7

細(xì)胞色素C2.910.7

菊糖酶0.348.2（4）導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。等電沉淀和蛋白電泳：

遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）

。電泳：

What’selectrophoresis?一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。1、蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要因素：水化膜----通過氫鍵與水結(jié)合表面電荷----在非等電點狀態(tài)下，雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。

蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠作用：蛋白質(zhì)顆粒周圍的水膜是不均勻,使它們以一定的部位結(jié)合形成長鏈。這些長鏈又彼此結(jié)合成為復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠體。

溶膠：蛋白質(zhì)作為分散相，水為連續(xù)相形成的溶液。

凝膠：蛋白質(zhì)為連續(xù)相，水為分散相形成的網(wǎng)狀凝膠體。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠具有脹潤作用：分類：（1）可逆性凝膠

（2）不可逆性凝膠部分破壞水化膜、適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點4.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用滲析（透析）超濾二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性與凝固作用

在某些物理或化學(xué)因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（肽鍵不斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。

What’sdenaturationofprotein?1、變性理論

蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式。2、引起蛋白質(zhì)變性的因素：①物理因素：

高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波、機械攪拌②化學(xué)因素：

強酸、強堿、有機溶劑、尿素、胍、重金屬鹽等。變性的因素及作用機制①物理性質(zhì)：

旋光性改變，溶解度下降，結(jié)晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：

官能團反應(yīng)性增加，呈色反應(yīng)增強，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：

原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。

變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變蛋白質(zhì)變性的可逆性－復(fù)性：某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)原來部分理化特性和生物學(xué)活性，這個過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性

蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下不能復(fù)性；如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu),并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性。核糖將核酸悟酶的透變性寺與復(fù)材性去除變性劑并緩慢氧化天然構(gòu)象尿素，-巰基乙醇變性狀態(tài)蛋白栗質(zhì)變低性的搶可逆理性與溉復(fù)性可逆閱變性特：變性君條件膨除去聯(lián)后仍埋可恢互復(fù)天裝然狀液態(tài)的爛變性孩。不可虎逆變拘性：變性女條件嚼除去電后不羽能恢它復(fù)天棵然狀吳態(tài)的姑變性遍。蛋白練質(zhì)的績熱變期性與凝固抄作用1、熱稼變性熱變錫性的脈定義熱變洋性三縫個階患段影響赴熱變合性的稀因素:溫度公、砂爬糖、H+濃度盾、蛋賤白質(zhì)材含水控量、釘電解業(yè)質(zhì)；蛋白繭質(zhì)的錄熱變或性與凝固軍作用2、蛋脂白質(zhì)李的凝埋固作甜用天然漲蛋白矮質(zhì)變舉性后史，變訂性蛋刻白質(zhì)脈分子塊互相殖凝集爸或相習(xí)互穿咱插纏米繞在托一起啊的現(xiàn)堡象成甚為蛋魂白質(zhì)較的凝箏固（co伴ag則ul祖at槍io批n）。凝固兆作用農(nóng)分兩年個階乏段：首先塞是變籠性；其次琴失去若規(guī)律刊性的瘦肽鏈池聚集明纏繞示在一令起而藥凝固擴或結(jié)培絮;蛋白昆質(zhì)變掩性的悠應(yīng)用理論間上：研究垂蛋白福質(zhì)分雞子結(jié)調(diào)構(gòu)與嫌功能,分子賤量測消定,亞單已位拆襖分；生產(chǎn)愧生活膽中有沾利的券一面銀：食品卡加工級，消矩毒滅津菌等瓦；非蛋忌白生類物物復(fù)質(zhì)提枯取純念化，蓋終止我酶促導(dǎo)反應(yīng)恰；生產(chǎn)搖生活店中不番利的棵一面?zhèn)龋夯钚哉叩鞍灼浦破放d（酶熄、抗棍體）浙的分技離提欄取和訴保存??；外加腦一些伏因素緞去除觸蛋白腦質(zhì)膠喘體的謠穩(wěn)定調(diào)因素查后，毛使蛋而白質(zhì)自分子執(zhí)相互榮聚集荒而從炸溶液認(rèn)中析外出的永現(xiàn)象剃稱為沉淀泡（pr女ec簡ip沙it蝴at碰io瞇n）。1.例W喘h(huán)a渣t’勝s殿pr置ec野ip脂it鏟at才io烘n狂of區(qū)p治ro悶te顏in康?變性把后的四蛋白劫質(zhì)由磨于疏爛水基蹦團的旦暴露撲而易候于沉稍淀，玻但沉淀姜的蛋戀白質(zhì)撿不一俗定都濃是變狠性后列的蛋仗白質(zhì)。四、呈蛋白微質(zhì)的刻沉淀夫作用2.沉淀督種類探：可逆墾與不襲可逆四、粘蛋白錄質(zhì)的近沉淀弦作用3.沉淀雪方法孫：沉淀臉后蛋咸白質(zhì)匆仍能然保持當(dāng)生物驚活性覺的沉疑淀方緊法沉淀恭后蛋六白質(zhì)揀失去忠生物算活性休的沉綠淀方蟲法2.沉淀綱種類翁：可逆渴與不漫可逆四、業(yè)蛋白群質(zhì)的陰沉淀未作用3.沉淀朗方法抄：沉淀腳后蛋矩白質(zhì)塑仍能糧保持肉生物憐活性獸的沉液淀方濟法（1）鹽揮析－剝中性舍鹽沉管淀法（2）有趨機溶爭劑沉跳淀法（3）酸敗沉淀霜法（1）鹽析—中性同鹽沉秤淀鹽溶蹦作用鹽析默作用Wh礙at?！痵福s姓al傍t值pr供ec讀ip熄it柳at光io放n蒸of脊p小ro報te山in曉?蛋白混質(zhì)仍坦能?；璩稚晡锘钚坌缘拿３恋砘椒ǎ?）鹽析—中性暫鹽沉蹄淀定義：在坑蛋白誤質(zhì)溶完液中墾加入蛇大量郵中性現(xiàn)鹽，粥以破被壞蛋改白質(zhì)昨的膠尸體性垂質(zhì)，淋使蛋攜白質(zhì)壓從溶暖液中濁沉淀琴析出魄，稱惡為鹽析擋（sa丸lt很p愧re喊ci洽pi狠ta遲ti錢on）。作用雕機制:中和駱電荷想的同機時破浴壞水煉化膜;Wh查at亦’s愁s垃al撐t厲pr薄ec伸ip膠it翻at鄙io圣n咳of良p決ro禽te召in則?蛋白著質(zhì)仍濟能保群持生濾物活臣性的水沉淀鐘方法常用母的中苗性鹽貝：硫酸績銨、氯當(dāng)化鈉供、硫今酸鈉潮等。鹽析載時，pH在蛋帖白質(zhì)臂的等優(yōu)電點脹處效膚果最培好。鹽析捆沉淀弊蛋白拖質(zhì)通浪常不記會引片起蛋尾白質(zhì)虎的變趴性。優(yōu)點鹽析憤應(yīng)用豬舉例（1）鹽析—中性變鹽沉斗淀蛋白種質(zhì)仍碼能保下持生混物活泊性的茶沉淀急方法分段凡鹽析療：半飽怠和硫酸愈銨溶敬液可塑沉淀烏分子襪量較機大的失血漿跑球蛋潮白,而飽和硫酸撓銨溶鎖液可尿沉淀水分子衛(wèi)量較叨小的瞞血漿啦清蛋毫白。因此,使用不同震濃度的硫鋼酸銨芽溶液泳就可某將分勵子量厚不同潤的蛋蓋白質(zhì)惰進行芳初步方分離須。（1）鹽析—中性牢鹽沉柏淀凡能滔與水蜓以任寄意比圍例混政合的遣有機液溶劑唱，如蝕乙醇影、甲作醇、俘丙酮緣瑞等，追均可正用于驅(qū)沉淀芝蛋白鏈質(zhì)。沉淀安原理桃：①隙脫水且作用——破壞群水化提膜；②辜使水滿的介長電常栽數(shù)降險低，狀蛋白孔質(zhì)溶茂解度循降低鵲。（2）有機逃溶劑次沉淀間法蛋白帝質(zhì)仍賤能保殿持生中物活繳性的合沉淀犁方法處理輩條件：①役低溫暴操作揮；②灶沉淀臭完全忙后盡艦快分勺離；（2）有機粉溶劑漏沉淀還法蛋白頸質(zhì)仍欣能保招持生服物活斤性的枕沉淀生方法機制：破壞險電荷導(dǎo)，等座電點勿沉淀挨。（3）酸沉鹽淀法（1）重趕金屬標(biāo)鹽沉佳淀法（2）生宴物堿基試劑逮沉淀盛法（銹除蛋脆白作鄰用）（3）熱葛凝固東沉淀緊法（4）抗宏體對距抗原傳蛋白緒質(zhì)的翅沉淀3.沉淀店方法談：沉淀鐵后蛋致白質(zhì)護仍能跨保持束生物慚活性沒的沉粉淀方姨法沉淀桃后蛋朽白質(zhì)晚失去熟生物最活性瞎的沉子淀方裁法四、茅蛋白窄質(zhì)的濁沉淀呈作用沉降債的概晴念沉降貼速率世：v=dx庫/d攀t沉降倒常數(shù)梨與單乎位應(yīng)用能：沉降儀速度肚法測食定分灣子量酬的原牌理；梯度友離心國分離佳蛋白伏質(zhì)（壁氯化闖銫）蟻；五、吵蛋白敵質(zhì)的鍋沉降片作用六、和蛋白扎質(zhì)的蹦顏色爭反應(yīng)1.雙縮摩脲反窯應(yīng)2.茚三爹酮反墨應(yīng)3.考馬觀斯亮傭藍G2犧504.福林悼酚試逆劑反革應(yīng)5.黃色憤反應(yīng)--芳香寬族氨未基酸糖的特派有反權(quán)應(yīng)6.米倫聰氏反跪應(yīng)—酪氨腹酸的即特有律反應(yīng)7.乙醛橋酸反別應(yīng)—色氨棟酸的吵特有券反應(yīng)8.坂口栗反應(yīng)—精氨煙酸特性有的矮反應(yīng)六、浸蛋白喪質(zhì)的土顏色炭反應(yīng)1.雙縮懇脲反宇應(yīng)兩分靈子雙吹縮脲熔與堿節(jié)性硫荷酸銅飛作用確，生雀成粉紅搜色復(fù)乒合物含有認(rèn)兩個蠟或兩你個以慮上肽鍵的化開合物咽，能攪發(fā)生類同樣叢反應(yīng)肽鍵飼的反挽應(yīng)，閱肽鍵艙越多題顏色淹越深岡，粉紅羨，紫巧紅，拿藍紫受蛋科白質(zhì)咐特異迫性影擺響小蛋白罵質(zhì)定盡量測池定；鑰測定款蛋白務(wù)質(zhì)水泡解程劃度六、婚蛋白蘿質(zhì)的業(yè)顏色互反應(yīng)2.茚三壁酮反劈燕應(yīng)靈敏狗度差滲。3.考馬寫斯亮長藍G-剃25謝0本身星為棕臺色，毯與蛋驕白質(zhì)養(yǎng)反應(yīng)述呈藍符色與蛋罰白的膊親和訂力強濫，靈南敏度績高1-暗--朱10泳00微克/毫升六、抖蛋白訴質(zhì)的歪顏色狼反應(yīng)4.福林疑酚試?yán)瑒┓蠢K應(yīng)酪氨愿酸、符色氨緣瑞酸的釋反應(yīng)歸（還鞭原反相應(yīng)）福林刺試劑炸：磷頂鉬酸-磷鎢福酸與雙如縮脲唇法結(jié)晶合--氏-Lo狠wr帶y法在堿彩性條敲件下自，蛋襯白質(zhì)途與硫計酸銅宵發(fā)生陸反應(yīng)蛋白索質(zhì)-銅絡(luò)印合物禽，將訂福林累試劑閣還原父，產(chǎn)厘生磷休鉬藍墻和磷渡鎢藍伍混合望物靈敏犬度提花高10糕0倍六、針蛋白鄰質(zhì)的莫顏色遷反應(yīng)5.黃色絹反應(yīng)--芳香酬族氨醒基酸的特存有反叛應(yīng)濃硝唇酸與酪氨松酸、襪色氨屆酸的反陽應(yīng)生成拼黃色胸化合蠟物指甲員、皮寇膚、鈔毛發(fā)6.米倫紫氏反些應(yīng)—酪氨揀酸的特源有反徐應(yīng)酪氨駁酸的煎顯色杠反應(yīng)饒（酚蘿羥基戴反應(yīng)奧）米倫脅試劑繞為硝鎖酸、匪亞硝太酸、久硝酸廟汞、嘆亞硝嶺酸汞華的混普合物蛋白納溶液襯中，肌加入窩米倫醉試劑矮，產(chǎn)房誠生白敞色沉診淀，均加熱越后變逮成紅退色六、盆蛋白吹質(zhì)的剛顏色浙反應(yīng)7.乙醛壩酸反背應(yīng)—色氨冊酸的特橡有反幼應(yīng)在蛋貝白質(zhì)掉溶液姥中加入HC趣OC顏OO葉H，將騙濃硫艇酸沿木管壁磁緩慢思加入持，不專使相蝦混，憐在液洗面交級界處頂，即凳有紫泉色環(huán)諒形成色氨次酸的濃反應(yīng)酒（吲登哚環(huán)鄉(xiāng)豐的反清應(yīng)）鑒定頂?shù)鞍谆钨|(zhì)中睜是否叮含有貨色氨軟酸明膠壘中不焦含色杏氨酸六、撐蛋白提質(zhì)的畜顏色店反應(yīng)8.坂口破反應(yīng)—精氨聽酸特有惰的反弄應(yīng)精氨遷酸的星反應(yīng)劉（胍浴基的吩反應(yīng)辰）精氨譜酸與α-萘酚棟在堿致性次摟氯酸懶鈉（盆或次憐溴酸支鈉）陪溶液弟中發(fā)經(jīng)生反崇應(yīng)，停產(chǎn)生刪紅色含產(chǎn)物鑒定露蛋白差質(zhì)中仗是否緒含有呢精氨碧酸定量瘦測定紀(jì)精氨肯酸七、劫蛋白鮮質(zhì)的談紫外糠吸收虛性質(zhì)大部巧分蛋押白質(zhì)望均含跟有帶湊芳香歌環(huán)的維苯丙健氨酸倒、酪摸氨酸稠和色汗氨酸妹。這三霜種氨鈔基酸方在28允0n親m附近堤有最析大吸洋收。涂因此夏，大熟多數(shù)策蛋白功質(zhì)在28飯0n秘m附近濫顯示遞強的蕉吸收刻。可頃以對穴蛋白耳質(zhì)進德行定佩性和鞠定量脫檢測悄。蛋白湊質(zhì)濃枝度（mg愚/m俯l）=1嚴(yán).4稠5A28醋0—0宣.7馬4A26梅0蛋白責(zé)質(zhì)的智分離慌純化一、部分離狐純化灑的基途本方淚法1、鹽初析與區(qū)等電貴點沉泛淀--揚-根據(jù)溶解壞度不同擦分離2、層初析法離子門交