強(qiáng)精煎抑制實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究【摘要】目的觀察強(qiáng)精煎對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸Fas和Fasl蛋白表達(dá)的影響，探討其抑制生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法將80只健康雄性昆明種小鼠分為正常組、模型組，強(qiáng)精煎組、黃精贊育膠囊組，除正常組用生理鹽水外其他各組均以環(huán)磷酰胺注射液40mg/kg腹腔注射造模，造模成功后，正常組及模型組分別給予蒸餾水，后兩組分別給予相應(yīng)藥物灌胃治療30d。第31天處死小鼠，利用H-E染色觀察小鼠睪丸病理形態(tài)，用免疫化學(xué)SABC法檢測(cè)Fas和Fasl蛋白在小鼠睪丸實(shí)質(zhì)組織中的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，強(qiáng)精煎組和黃精贊育膠囊組睪丸Johnson評(píng)分偏高，F(xiàn)as和Fasl蛋白的表達(dá)率偏低();與空白組比較，模型組Johnson評(píng)分偏低，F(xiàn)as和Fasl蛋白表達(dá)率偏高();強(qiáng)精煎組和黃精贊育膠囊組差異無(wú)學(xué)意義()。結(jié)論強(qiáng)精煎可以下調(diào)Fas和Fasl蛋白在受損傷小鼠睪丸實(shí)質(zhì)組織中的表達(dá)，這可能是其抑制生精細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】強(qiáng)精煎;生精功能障礙;實(shí)驗(yàn)研究

大量研究表明，生精細(xì)胞的過(guò)度凋亡是導(dǎo)致生精功能障礙的重要病因，而Fas/Fasl系統(tǒng)在生殖細(xì)胞的凋亡中又起著重要作用。我們前期的研究顯示，以補(bǔ)腎健脾為主要功效的中藥強(qiáng)精煎具有抑制環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸生精細(xì)胞過(guò)度凋亡的作用，而該作用機(jī)制是否也與Fas/Fasl系統(tǒng)有關(guān)尚不清楚，為此筆者進(jìn)行了初步探索。

1材料

藥物強(qiáng)精煎(方，主要由菟絲子、枸杞子、益母草、當(dāng)歸、黨參、牡蠣組成)，為提高本實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，采用單味中藥配方顆粒，由江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0803193，將各單味藥物倒入量杯，加入100℃蒸餾水，充分混勻，配成藥物濃度為g/ml的混懸液，密封，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩｜S精贊育膠囊(由何首烏、黃精、菟絲子、枸杞子、五味子、熟地黃等組成)，上海新亞藥業(yè)邗江有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：080101。去除膠囊外殼，將膠囊內(nèi)藥物顆粒研磨成粉狀，80目過(guò)篩后，加入蒸餾水繼續(xù)研末5min，配成藥物濃度為5g/ml的混懸液，密封，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑注射用環(huán)磷酰胺(CP)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：08012921。以%氯化鈉注射液配制成4mg/ml的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用;Bouin液：將冰醋酸、甲醛、苦味酸飽和水溶液按1∶5∶15比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用;即用型Fas、Fasl多克隆抗體及SABC免疫組化染色試劑盒(標(biāo)記長(zhǎng)臂的生物素羊抗兔IgG、親和素、過(guò)氧化物酶)，底物DAB顯色試劑盒，PBS緩沖液，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

動(dòng)物8～9周齡健康雄性昆明種小鼠80只，清潔級(jí)，體重(33±)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2003-0003，購(gòu)回后飼養(yǎng)在廣西中院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，檢疫1周，根據(jù)體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、黃精贊育膠囊組和強(qiáng)精煎，每組20只。

2方法

造模及給藥方法采用環(huán)磷酰胺致小鼠生精功能障礙模型，方法參考陳守真法，除正常組給予等劑量生理鹽水外，其余各組以環(huán)磷酰胺每天按40mg/kg體重進(jìn)行腹腔注射，1次/d，連續(xù)5d。造模結(jié)束后第1天即給予藥物治療。對(duì)照組及治療組分別灌胃黃精贊育膠囊混懸液或強(qiáng)精煎混懸液ml/d(按體質(zhì)量30g的小鼠體表面積折算均相當(dāng)于體質(zhì)量60kg的成人用量)，正常組和模型組均以等量蒸餾水代替，1次/d，連續(xù)30d。第31天用頸椎脫臼法處死小鼠，取左側(cè)睪丸，放在Bouin液中固定，24h內(nèi)取出，用自動(dòng)脫水機(jī)脫水后，用包埋機(jī)包埋成蠟塊備用。

睪丸組織病理形態(tài)的觀察將已經(jīng)用石蠟包埋的睪丸標(biāo)本切成厚約4μm的連續(xù)石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)，采用Johnson評(píng)分法評(píng)價(jià)精子發(fā)生和精子發(fā)生障礙的程度。生精功能正常為10分;各期生精細(xì)胞存在，但排列紊亂為9分;生精小管中有少量精子(5～10個(gè))為8分;無(wú)精子，但有許多精子細(xì)胞為7分;無(wú)精子，僅有少量精子細(xì)胞(5～10個(gè))為6分;無(wú)精子，但有許多精母細(xì)胞為5分;無(wú)精子細(xì)胞，僅有個(gè)別精母細(xì)胞(5個(gè))為4分;僅有精原細(xì)胞為3分;無(wú)生精細(xì)胞，僅有支持細(xì)胞的為2分;管腔內(nèi)無(wú)細(xì)胞為1分。評(píng)分越高精子發(fā)生越好，反之，精子發(fā)生障礙程度越嚴(yán)重。

睪丸組織Fas及Fasl蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)嚴(yán)格按照博士德公司所提供的免疫組化SABC法操作步驟分別檢測(cè)Fas和Fasl，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照。鏡檢睪丸組織細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色染色為陽(yáng)性細(xì)胞。在高倍鏡下(400×)隨機(jī)檢測(cè)5個(gè)視野，計(jì)算500～1000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法參數(shù)統(tǒng)計(jì)用方差分析，q檢驗(yàn);非參數(shù)統(tǒng)計(jì)用秩和檢驗(yàn)。全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)處理，作相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

3結(jié)果

病理形態(tài)觀察結(jié)果因操作不當(dāng)，于造模開(kāi)始至第1周先后有8只小鼠死亡。各組的Johnson評(píng)分比較見(jiàn)表1。因正常組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性分布，故采用成組設(shè)計(jì)多組秩和兩兩比較的q檢驗(yàn)法檢驗(yàn)。

Fas和Fasl蛋白表達(dá)率的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。Fas各組采用秩和檢驗(yàn);Fasl各組采用方差分析，組間比較F=。表14組小鼠睪丸病理形態(tài)的Johnson評(píng)分比較表2各組小鼠睪丸Fas蛋白表達(dá)率的比較與正常組比較，

，

;與模型組比較，◆，◆◆;與黃精贊育膠囊組比較，*，**;n=18

各組的間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、各級(jí)生精細(xì)胞及精子均可見(jiàn)Fas和Fasl蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。Fas多表達(dá)在精母細(xì)胞、精子及其周?chē)鷼埩舭麧{中，F(xiàn)asl多表達(dá)在間質(zhì)區(qū)。

病理?yè)p傷程度與Fas及Fasl蛋白表達(dá)率的關(guān)系見(jiàn)表3。表372例小鼠睪丸病理?yè)p傷程度、Fas和Fasl蛋白表達(dá)率間的Pearson相關(guān)系數(shù)

4討論

生精細(xì)胞過(guò)度凋亡是造成睪丸生精功能障礙的直接原因。以往的研究表明，以補(bǔ)腎健脾為主要功效的方強(qiáng)精煎具有修復(fù)睪丸病理?yè)p傷，降低睪丸生精細(xì)胞凋亡率的作用，治療少弱精子癥可以有效改善精子質(zhì)量[2,5,6]。本次研究也顯示，腹腔注射環(huán)磷酰胺后，模型組小鼠睪丸Johnson評(píng)分較正常組明顯偏低，而給予強(qiáng)精煎灌胃的治療組Johnson評(píng)分則較模型組有明顯改善，與之前的研究相符。

生精細(xì)胞凋亡有多種調(diào)節(jié)機(jī)制，其中胱門(mén)蛋白酶在生精小管凋亡調(diào)控中具有作用，其中涉及死亡受體Fas及其配體Fasl的信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物生精細(xì)胞凋亡通過(guò)胱門(mén)蛋白酶的主要途徑之一。該通路又稱(chēng)為外源性通路，F(xiàn)as為一個(gè)單跨膜受體蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族，當(dāng)其與之配體Fasl結(jié)合后可導(dǎo)致Fas三聚化，后者通過(guò)死亡結(jié)構(gòu)域(DD)與Fas-相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)結(jié)合。FADD的N-末端還包括死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)。Fas/FADD復(fù)合物隨后通過(guò)FADD上的DED與胱門(mén)蛋白酶原8或10結(jié)合，并激活后者，從而啟動(dòng)分解信號(hào)并導(dǎo)致細(xì)胞解體。國(guó)內(nèi)研究證實(shí)，F(xiàn)as及Fasl系統(tǒng)確實(shí)可以介導(dǎo)生精細(xì)胞的過(guò)度凋亡，引起生精功能障礙，并且其定位不只局限在生精小管內(nèi)，亦可能發(fā)生在間質(zhì)細(xì)胞中。本次實(shí)驗(yàn)也觀察到，模型組各級(jí)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞都可見(jiàn)Fas和Fasl的高表達(dá)，且Fasl多表達(dá)在間質(zhì)區(qū)，F(xiàn)as多表達(dá)在生精細(xì)胞。同時(shí)，顯示，所有小鼠睪丸Johnson評(píng)分總體與Fas和Fasl的表達(dá)率間分別呈負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明Fas和Fasl系統(tǒng)可能在環(huán)磷酰胺所致的小鼠生精細(xì)胞過(guò)度凋亡中發(fā)揮著重要作用，而且靶點(diǎn)較為廣泛。組間比較顯示，強(qiáng)精煎組Johnson評(píng)分和Fas及Fasl表達(dá)率與正常組和黃精贊育膠囊組無(wú)明顯區(qū)別，但與模型組區(qū)別顯著，說(shuō)明強(qiáng)精煎同黃精贊育膠囊一樣，可以下調(diào)Fas和Fasl在丸中的表達(dá)，這可能是其降低生精細(xì)胞凋亡率，修復(fù)組織損傷，改善受損的生精功能的分子機(jī)制之一。

本次實(shí)驗(yàn)在觀察中還注意到，強(qiáng)精煎組小鼠睪丸的三類(lèi)細(xì)胞中Fas和Fasl表達(dá)率均較模型組有所減少，說(shuō)明其對(duì)三類(lèi)細(xì)胞均有影響。我們知道，間質(zhì)細(xì)胞可以接受黃體生成素的刺激信號(hào)分泌睪酮，而睪酮通過(guò)調(diào)節(jié)支持細(xì)胞，又對(duì)生精細(xì)胞的生存和分化具有重要調(diào)控作用，同時(shí)Francavilla等的研究又表明，人類(lèi)睪丸Fas和Fasl的表達(dá)是在促性腺激素控制下進(jìn)行的。所以這可能意味著，強(qiáng)精煎抑制生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制中除了Fas和Fasl系統(tǒng)的直接作用外可能還有內(nèi)分泌因素的存在，這有待于今后作進(jìn)一步探討。

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