分子生物學(xué)原核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控第一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五組成型表達(dá)和調(diào)節(jié)型表達(dá)

在細(xì)胞中，有些基因產(chǎn)物的量是比較恒定的，它們是細(xì)胞維持代謝必需的物質(zhì)，如糖酵解途徑中的酶及組成核糖體的蛋白質(zhì)，這類基因的表達(dá)稱為組成型表達(dá)（constitutiveexpression）；有些基因產(chǎn)物的量在不同的情況下變化很大，需要這類產(chǎn)物時(shí)基因表達(dá)，不需要時(shí)基因關(guān)閉，這類基因的表達(dá)稱為調(diào)節(jié)型表達(dá)（regulatedexpression）。第二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五真核與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控特點(diǎn)的比較第三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)方式①

代謝產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)②

衰減子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)③

降解物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)④

細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

第四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五1.代謝產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

在降解代謝途徑中，起始端的酶的底物濃度往往決定是否合成這一途徑中后續(xù)的各種酶（誘導(dǎo)）；而在合成代謝中，最終產(chǎn)物往往是調(diào)節(jié)物質(zhì)（阻遏）。這些調(diào)節(jié)物質(zhì)必須與反式作用因子結(jié)合才能起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。

第五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五2.衰減子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

在這種調(diào)節(jié)方式中，起信號(hào)作用的是特定氨酰－tRNA的濃度，如對(duì)色氨酸操縱子來說，高濃度的色氨酰－tRNA抑制色氨酸操縱子的表達(dá)。具有這種調(diào)節(jié)方式的有大腸桿菌中的色氨酸操縱子、苯丙氨酸操縱子、蘇氨酸操縱子、異亮氨酸操縱子和纈氨酸操縱子，以及沙門氏菌的組氨酸操縱子和亮氨酸操縱子、嘧啶合成操縱子等。第六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五3.降解物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

在有葡萄糖存在的情況下，即使在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麥芽糖等誘導(dǎo)物，與其對(duì)應(yīng)的操縱子也不會(huì)啟動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)或稱為降解物抑制作用。這時(shí)，細(xì)菌所需的能量可以從葡萄糖得到滿足，而無須啟動(dòng)一些不常用的基因去利用這些稀有的糖類。第七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五降解物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

其機(jī)制是葡萄糖的存在會(huì)抑制細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶，減少cAMP的合成，cAMP受體蛋白因不能與cAMP結(jié)合而不能形成復(fù)合物。這種復(fù)合物是一個(gè)正調(diào)節(jié)物質(zhì)，它可與操縱子上的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。若培養(yǎng)基中缺乏葡萄糖，而有其它種類的糖，相應(yīng)的操縱子就會(huì)啟動(dòng)。第八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五4.細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

上述3個(gè)方面是細(xì)菌處于正常生活條件下的基因表達(dá)調(diào)節(jié)方式，這種正常也包括生活環(huán)境中缺少某一種或兩種物質(zhì)，但能找到代用物?？墒?，細(xì)菌有時(shí)會(huì)遇到十分惡劣的環(huán)境，比如氨基酸饑餓時(shí)，就不是缺少一兩種氨基酸，而是氨基酸全面匱乏。為了緊縮開支，渡過難關(guān)，細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)，包括合成各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生化反應(yīng)過程均被停止。第九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

當(dāng)氨基酸饑餓時(shí)，細(xì)胞中便存在大量的不帶氨基酸的tRNA，這種空載tRNA會(huì)激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，使ppGpp大量合成，其濃度可增加10倍以上，ppGpp的出現(xiàn)會(huì)關(guān)閉許多基因，當(dāng)然也會(huì)打開一些合成氨基酸的基因。ppGpp的作用原理還不清楚，它不只影響一個(gè)或幾個(gè)操縱子，而是影響一大批操縱子，所以它是超級(jí)調(diào)控因子。第十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五原核基因啟動(dòng)子的一般結(jié)構(gòu)

原核生物基因的啟動(dòng)子有兩個(gè)保守的區(qū)域，一個(gè)位于－10處，稱為Pribnowbox，另一個(gè)位于－35處，稱為Sextamabox。它們的保守性為SextamaboxPribnowboxT82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T96

通過缺失分析發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)啟動(dòng)子Pribnowbox和Sextamabox之間的間隔為17±1bp，增大或減小這個(gè)間距能明顯影響啟動(dòng)子的強(qiáng)度。第十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五幾種原核基因的啟動(dòng)子第十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五原核生物的RNA聚合酶

原核細(xì)胞中只有一種RNA聚合酶，它催化所有種類RNA的合成。真核細(xì)胞中有三種RNA聚合酶，分別稱為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，它們催化合成的RNA種類不同。第十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶通常認(rèn)為由5個(gè)亞基組成，即α2、β、β＇及σ，這5個(gè)亞基組成的酶叫全酶，而只由α2、β、β＇4個(gè)亞基組成的酶叫做核心酶。此外，還可以看到一個(gè)相對(duì)分子量在10000左右的ω亞基，其功能尚不清楚；后來又發(fā)現(xiàn)一個(gè)分子量為69000的酸性蛋白，稱為NusA蛋白，現(xiàn)在又稱為轉(zhuǎn)錄延伸因子，其功能可能與RNA轉(zhuǎn)錄的延伸和終止有關(guān)。第十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌RNA聚合酶各亞基的功能

σ亞基的主要功能是識(shí)別啟動(dòng)子；α亞基的主要功能是參與和啟動(dòng)子的結(jié)合、DNA雙鏈的解鏈和恢復(fù)雙螺旋；β亞基可能參與底物的結(jié)合及RNA合成時(shí)磷酸二酯鍵的形成；β＇亞基的堿性最強(qiáng)，可能起到與DNA模板結(jié)合的作用。第十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五RNA的轉(zhuǎn)錄過程

原核RNA聚合酶通過σ亞基發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子－35區(qū)識(shí)別位點(diǎn)后，首先與－35區(qū)序列結(jié)合成一個(gè)封閉的啟動(dòng)子復(fù)合體，幾乎與此同時(shí)，全酶向－10序列轉(zhuǎn)移并與之緊密結(jié)合，使－10區(qū)及轉(zhuǎn)錄起始區(qū)發(fā)生局部解鏈而形成開放型復(fù)合體。轉(zhuǎn)錄起始第十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五RNA的轉(zhuǎn)錄過程

在開放型復(fù)合體中，RNA聚合酶上的起始位點(diǎn)和延伸位點(diǎn)分別被兩個(gè)相應(yīng)的核苷三磷酸按堿基配對(duì)原則占據(jù)（起始位點(diǎn)只允許嘌呤核苷三磷酸進(jìn)入），在β亞基催化下形成第一個(gè)磷酸二酯鍵，這樣就形成了一個(gè)RNA聚合酶—DNA—新生RNA的三元復(fù)合體。三元復(fù)合體一旦形成，σ亞基就從全酶上解離下來，此時(shí)轉(zhuǎn)錄起始完成，進(jìn)入延伸階段。轉(zhuǎn)錄起始第十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)錄起始過程第十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五RNA的轉(zhuǎn)錄過程RNA合成的速度大約每秒30～50個(gè)核苷酸。轉(zhuǎn)錄延伸第十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五RNA的轉(zhuǎn)錄過程

原核基因轉(zhuǎn)錄的終止機(jī)制比較清楚。以大腸桿菌為例，轉(zhuǎn)錄的終止需要一個(gè)信號(hào)，這個(gè)信號(hào)就是一個(gè)叫做轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或終止子（terminator）的DNA序列。終止子序列存在于已被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄過的序列中。

轉(zhuǎn)錄終止第二十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五終止子的類型

已知有兩類終止子：一類是不依賴蛋白輔助因子而能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止的終止子，叫做ρ-非依賴性終止子；另一類是依賴蛋白輔助因子ρ才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止的終止子，叫做ρ-依賴性終止子。第二十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五ρ-非依賴性終止子第二十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五ρ-非依賴性終止機(jī)制

ρ-非依賴性終止子不是在DNA水平上終止轉(zhuǎn)錄的，而是在已轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA水平上發(fā)生作用的。終止子序列從DNA模板上轉(zhuǎn)錄后，在新生RNA鏈中產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在發(fā)卡結(jié)構(gòu)后面跟著大約由6個(gè)U組成的序列。這兩種結(jié)構(gòu)都為轉(zhuǎn)錄終止所必需。如果在發(fā)卡區(qū)產(chǎn)生突變，破壞其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，會(huì)妨礙轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶在發(fā)卡處通過相互作用使RNA轉(zhuǎn)錄停滯，而一連串的U提供了使RNA聚合酶從模板上解離下來的信號(hào)而使轉(zhuǎn)錄終止。第二十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五ρ-依賴性終止子

在ρ-依賴性終止子中，轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前也有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，但發(fā)卡結(jié)構(gòu)中GC對(duì)含量較少，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的下游序列沒有固定的特征，其AT對(duì)含量比ρ-非依賴性轉(zhuǎn)錄終止子低。ρ-因子利用其NTP酶活性產(chǎn)生的能量，結(jié)合到RNA鏈上，然后沿著RNA鏈滑向RNA聚合酶，當(dāng)RNA聚合酶在發(fā)卡結(jié)構(gòu)處停滯時(shí)，ρ-因子與RNA聚合酶相互作用而終止轉(zhuǎn)錄。第二十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五ρ依賴性終止機(jī)制RNA聚合酶正在轉(zhuǎn)錄ρ因子附著到RNA的識(shí)別位點(diǎn)上ρ因子沿RNA移動(dòng)，追趕RNA聚合酶在終止子處，ρ因子與RNA聚合酶相互作用在轉(zhuǎn)錄泡處，ρ因子使DNA-RNA雜交雙鏈解旋轉(zhuǎn)錄終止第二十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五終止子的終止效率

ρ-非依賴性轉(zhuǎn)錄終止在有ρ-因子參與時(shí)，終止效率提高；終止子序列發(fā)卡結(jié)構(gòu)中GC含量高時(shí)，終止效率高。Thesequencesrequiredforrho-dependenttermination(sometimescalledrutsites)are50-90baseslongandlieupstreamoftheactualterminationsite.TheircommonfeatureisthattheRNAisrichinCresiduesandpoorinGresidues.Cisbyfarthemostcommonbase(41%)andGistheleastcommonbase(14%).Asageneralruletheefficiencyofarut

siteincreaseswiththelengthoftheC-rich/G-poorregion.第二十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Rut位點(diǎn)的序列特征Arut

sitehasasequencerichinCandpoorinGprecedingtheactualsite(s)oftermination.Thesequencecorrespodnstothe3￠endoftheRNA.第二十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子

乳糖操縱子控制3個(gè)酶的表達(dá)。即lac

Z、lac

Y、lac

A，它們分別編碼β－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷透過酶和β－半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶。由于多順反子mRNA中各基因翻譯效率的不同，β-半乳糖苷酶：β－半乳糖苷透過酶：β－半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶合成的比例為1：0.5：0.2。大腸桿菌如果以乳糖為唯一碳源和能源的話，前兩種酶是必需的。

lacoperon第二十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五lacA的可能作用NodefectisidentifiableinlacA-

cells,whichispuzzling.Itispossiblethattheacetylationreactiongivesanadvantagewhenthebacteriagrowinthepresenceofcertainanalogsofb-galactosidesthatcannotbemetabolized,becausethemodificationresultsindetoxificationandexcretion.第二十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控

在不含乳糖及β－半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)β－半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)大約只有1～2個(gè)酶分子，這稱為本底表達(dá)。但是，如果在無葡萄糖的培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6～7%，每個(gè)細(xì)胞中可有超過105個(gè)酶分子。第三十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控半衰期長(zhǎng)半衰期長(zhǎng)第三十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的人工誘導(dǎo)物和底物

實(shí)際研究中，很少使用乳糖作為誘導(dǎo)劑，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的乳糖會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶降解，使乳糖的濃度不斷下降。實(shí)驗(yàn)室里常常使用兩種含硫的乳糖類似物異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或甲基硫代半乳糖苷（TMG）作為誘導(dǎo)劑。在酶活性分析中常用O－硝基苯半乳糖苷（ONPG）作為生色底物。第三十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的

人工誘導(dǎo)物和活性測(cè)定底物

誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物生色底物O-硝基苯半乳糖苷(ONPG)第三十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)

1940年，JacquesMonod等開始研究大腸桿菌中乳糖代謝的可誘導(dǎo)性。他們發(fā)現(xiàn)乳糖或其他半乳糖苷能夠誘導(dǎo)β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）的表達(dá)?？墒?，有些突變體能夠被誘導(dǎo)出β－半乳糖苷酶，但仍不能在僅含乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。他們將放射性標(biāo)記的半乳糖苷加到野生型和突變型的大腸桿菌中，并分別進(jìn)行誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)條件下，野生型可以吸收半乳糖苷，而突變型（Y－）不能吸收半乳糖苷。第三十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Effectof

CrypticMutant（lzcY－）onAccumulationofGalactosideGenotypeInducerAccumulationofGalactosideZ+Y+－－Z+Y+＋＋Z+Y－－－Z+Y－＋－第三十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五對(duì)突變體的生物化學(xué)研究

Monod認(rèn)為有一種物質(zhì)負(fù)責(zé)將半乳糖苷運(yùn)入細(xì)胞，Y－突變型產(chǎn)生這種物質(zhì)的基因有缺陷。他將這種物質(zhì)命名為半乳糖苷透過酶（galactosidepermease）。在純化半乳糖苷透過酶時(shí)，Monod等又發(fā)現(xiàn)了半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰基酶（galactosidetransacetylase）到上世紀(jì)50年代末期，Monod發(fā)現(xiàn)這三種酶被半乳糖苷同時(shí)誘導(dǎo)出來，因此至少有三個(gè)基因被同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。他還發(fā)現(xiàn)了一些突變體，這些突變體不需要誘導(dǎo)就能持續(xù)表達(dá)這三種酶。這些突變體稱為組成型突變體（constitutivemutants）。第三十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五對(duì)突變體的遺傳學(xué)研究

Monod認(rèn)識(shí)到，遺傳學(xué)分析可以大大促進(jìn)研究的進(jìn)展，于是他請(qǐng)同在巴斯德研究所的FrancoisJacob參加到他的團(tuán)隊(duì)中。在ArthurPardee的協(xié)助下，Jacob和Monod制作了大腸桿菌部分二倍體（merodiploids），這些部分二倍體攜帶了野生型基因（可誘導(dǎo)的）和組成型突變體的等位基因。實(shí)驗(yàn)表明野生型基因是顯性的(即組成型突變基因也不表達(dá))，說明野生型細(xì)胞可以產(chǎn)生一種物質(zhì)，它使得基因關(guān)閉，除非被誘導(dǎo)。這種物質(zhì)被稱為阻遏蛋白（repressor），組成型突變體不能產(chǎn)生這種阻遏蛋白，野生型基因產(chǎn)生的阻遏蛋白可以抑制組成型突變基因的表達(dá)。這些組成型突變體記為lacI－。第三十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Mutantrepressorgene（I－）NolacproductsinabsenceoflactoseNolacproductsinabsenceoflactoseBothlacoperonsrepressible；mutationisrecessive.（Inmerodiploidcells）第三十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五對(duì)突變體的遺傳學(xué)研究

阻遏蛋白要發(fā)揮作用，應(yīng)該結(jié)合到DNA的特殊序列上，Jacob和Monod將這種特殊序列稱為操縱區(qū)（operator）。可以想象，即使有阻遏蛋白，操縱區(qū)突變，阻遏蛋白無法與操縱區(qū)結(jié)合，也會(huì)使得三種酶組成型表達(dá)。區(qū)分這兩種突變的方法是：在部分二倍體細(xì)胞中，如果是阻遏蛋白基因突變（I

－），不產(chǎn)生阻遏蛋白，表型是隱性的（recessive）；如果是操縱區(qū)突變（Oc），突變基因成為組成型表達(dá)，表型是顯性的，這種顯性稱為順式顯性（cis-dominant），而野生型基因仍須誘導(dǎo)才能表達(dá)。第三十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Mutantoperator（O

c）NolacproductsinabsenceoflactoselacproductsinabsenceoflactoseOnelacoperonnonrepressible；mutationiscis-dominant.（Inmerodiploidcells）第四十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五對(duì)突變體的遺傳學(xué)研究

有一種阻遏蛋白突變，突變的阻遏蛋白不能與誘導(dǎo)物結(jié)合，因此結(jié)構(gòu)基因經(jīng)誘導(dǎo)也不能表達(dá)。這種突變稱為I

s，這種突變是順反都顯性的。NolacproductsinpresenceorabsenceoflactoseNolacproductsinpresenceorabsenceoflactoseBothlacoperonsuninducible；mutationiscis-andtrans-dominant.第四十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五對(duì)突變體的遺傳學(xué)研究

還有一種阻遏蛋白突變，突變的阻遏蛋白不能與操縱區(qū)結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因組成型表達(dá)，這種突變稱為I－d，這種突變叫顯性陰性（dominantnegative）。lacproductsinabsenceoflactoselacproductsinabsenceoflactoseBothoperonsnonrepressible；mutationisdominantnegative.第四十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子概念的提出

通過熟練的遺傳學(xué)分析，Jacob和Monod提出了操縱子的概念。他們預(yù)言有兩個(gè)關(guān)鍵的控制元件存在：阻遏蛋白基因和操縱區(qū)。缺失突變揭示了第三個(gè)元件——啟動(dòng)子，它對(duì)三個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)是必需的。他們得出結(jié)論，三個(gè)結(jié)構(gòu)基因是成簇排列，并處于一個(gè)控制單位的控制之下，即乳糖操縱子。隨后的生化研究證實(shí)了他們完美的假說。第四十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五lacrepressor的純化

20世紀(jì)60年代，Gilbert和Muller-Hill成功地部分純化了lac阻遏蛋白。開始時(shí)采用標(biāo)記的IPTG與阻遏蛋白結(jié)合的方法來檢測(cè)阻遏蛋白，但因Lac阻遏蛋白含量非常低，無法檢測(cè)到。后來從一個(gè)突變體lacI

t中純化出了阻遏蛋白，這種阻遏蛋白與IPTG結(jié)合非常緊密，這樣就能從粗提物中檢測(cè)到阻遏蛋白。第四十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五lacrepressor與operator的結(jié)合

Cohn和他的同事用純化的阻遏蛋白進(jìn)行與operator的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。他們將含有l(wèi)acoperator的標(biāo)記DNA片段加到固定有不同量的repressor的硝酸纖維素濾膜上，然后測(cè)定濾膜上結(jié)合的DNA的量，并在加和不加IPTG兩種情況下實(shí)驗(yàn)，得到如下結(jié)果：第四十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五

Assayingthebindingbetweenlacoperatorandlacrepressor不加IPTG加IPTG第四十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五TheOclacoperatorbindsrepressorwithloweraffinitythandoesthewild-typeoperator含正常operator的DNA片段含Oc突變operator的DNA片段Λφ80DNA片段（對(duì)照）第四十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Pastan等的實(shí)驗(yàn)

早在1971年，Pastan及其同事就通過實(shí)驗(yàn)證明：即使repressor存在，RNA聚合酶也能夠緊密地結(jié)合到promoter上。他們的實(shí)驗(yàn)是：在repressor存在下，將含有operator的DNA片段與RNA聚合酶保溫，然后同時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG和利福平。利福平能夠抑制轉(zhuǎn)錄，除非已經(jīng)形成了開放的啟動(dòng)子復(fù)合物。結(jié)果轉(zhuǎn)錄發(fā)生了，說明repressor沒有阻止開放啟動(dòng)子復(fù)合物的形成。即使有了這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人們還是認(rèn)為repressor與operator的結(jié)合阻礙了RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。第四十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)錄起始開放復(fù)合物的形成第四十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Straney和Crothers的實(shí)驗(yàn)

1987年，Straney和Crothers用實(shí)驗(yàn)強(qiáng)化了這個(gè)觀點(diǎn)：RNA聚合酶和阻遏蛋白可以同時(shí)結(jié)合到lac啟動(dòng)子上。他們提出，盡管阻遏蛋白不影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，但阻止開放復(fù)合物的形成。

這個(gè)觀點(diǎn)與Pastan等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符。第五十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Krummel和Chamberlin的觀點(diǎn)

Krummel和Chamberlin提出另外一種解釋：阻遏蛋白阻止從起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物狀態(tài)轉(zhuǎn)變成延伸狀態(tài)。換句話說，阻遏蛋白可以合成短的RNA，但不能繼續(xù)合成RNA。第五十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Lee和Goldfarb的實(shí)驗(yàn)

Lee和Goldfarb提出了實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持了Krummel和Chamberlin的觀點(diǎn)。他們用run-off轉(zhuǎn)錄分析法證明，即使在阻遏蛋白存在下，RNA聚合酶也已經(jīng)與DNA模板發(fā)生了相互作用。實(shí)驗(yàn)方法如下：

將阻遏蛋白與含有l(wèi)ac控制區(qū)域及l(fā)acZN端部分序列的123bp的DNA片段保溫10分鐘，使阻遏蛋白與operator結(jié)合，然后加入RNA聚合酶，再加入肝素及RNA聚合酶反應(yīng)所需的其他全部成分（除CTP外）。肝素結(jié)合到游離的或與DNA松散結(jié)合的RNA聚合酶上，阻止這些RNA聚合酶與DNA緊密結(jié)合，但并不影響已經(jīng)與DNA緊密結(jié)合的RNA聚合酶。最后加入標(biāo)記的CTP，同時(shí)加和不加IPTG。第五十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Lee和Goldfarb的實(shí)驗(yàn)結(jié)果-runofflacR－++IPTG－－+Run-off：合成一小段結(jié)構(gòu)基因的RNA

結(jié)果表明，阻遏蛋白不能阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子形成開放復(fù)合物。Lee和Goldfarb還注意到，在阻遏蛋白存在時(shí)，有一個(gè)僅6個(gè)核苷酸長(zhǎng)的不全轉(zhuǎn)錄物（abortivetranscripts）產(chǎn)生。這說明阻遏蛋白實(shí)際上是抑制了從產(chǎn)生不全轉(zhuǎn)錄物的無效轉(zhuǎn)錄到連續(xù)轉(zhuǎn)錄這個(gè)轉(zhuǎn)變過程。第五十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1965"fortheirdiscoveriesconcerninggeneticcontrolofenzymeandvirussynthesis"Fran?oisJacobAndréLwoffJacquesMonodInstitutPasteur,Paris,France第五十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的阻遏調(diào)控

lacI的表達(dá)產(chǎn)物是四聚體的阻遏蛋白（repressor），它結(jié)合到乳糖操縱子的操縱區(qū)（operator），使轉(zhuǎn)錄不能進(jìn)行。當(dāng)有誘導(dǎo)物（inducer）存在時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，結(jié)合的復(fù)合物不能與操縱區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。第五十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的阻遏調(diào)控

實(shí)際上，以乳糖為誘導(dǎo)物時(shí)，并不是乳糖和阻遏蛋白結(jié)合，而是由乳糖（半乳糖－β－1,4－葡萄糖）的異構(gòu)體異構(gòu)乳糖（半乳糖－β－1,6－葡萄糖）與阻遏蛋白結(jié)合。由乳糖轉(zhuǎn)變成異構(gòu)乳糖是由β－半乳糖苷酶催化的。在β－半乳糖苷酶催化下，多數(shù)乳糖降解成葡萄糖和半乳糖，也生成一些異構(gòu)乳糖，使得操縱子處于開放狀態(tài)。第五十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的阻遏調(diào)控第五十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五Operator的結(jié)構(gòu)-5+21第五十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的三個(gè)OperatorMajoroperatorAuxiliaryoperatorAuxiliaryoperator第五十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子的三個(gè)Operator

缺失對(duì)基因表達(dá)的影響右邊的數(shù)字是加inducer與不加inducer時(shí)β－半乳糖苷酶活性之比第六十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五阻遏蛋白四聚體結(jié)合到兩個(gè)operator上使DNA成環(huán)DNA彎曲成環(huán)提高了阻遏的效率第六十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子表達(dá)中的葡萄糖效應(yīng)

當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)，細(xì)胞吸收葡萄糖，葡萄糖與半乳糖苷透過酶結(jié)合，阻止乳糖吸收。這叫誘導(dǎo)物排斥（inducerexclusion）。第六十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五InducerExclusionThekeymolecularcomponentininducerexclusionisthePTS(phosphoenolpyruvate:glucosephosphotransfer-asesystem),acomplexofproteinsinthebacterialmembrane,whichsimultaneouslyphosphorylatesandtransportssugarsintothecell.Oneoftheproteinsofthiscomplex(II

AGlc,whichiscode

dbythecrr

gene)becomesdephosphorylatedasaresultofglucosetransport.ItthenbindstotheLacpermeaseandpreventsitfromimportinglactoseintothecell.第六十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五葡萄糖抑制乳糖輸入第六十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子表達(dá)中的葡萄糖效應(yīng)

除了抑制乳糖吸收外，葡萄糖還通過另一種機(jī)制阻止乳糖操縱子表達(dá)。PTS中的II

AGlc在磷酸化狀態(tài)時(shí)刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性，使ATP轉(zhuǎn)變成cAMP，當(dāng)介質(zhì)中有葡萄糖時(shí)，II

AGlc在輸入葡萄糖的過程中，本身被脫磷酸化，脫磷酸化的II

AGlc降低腺苷酸環(huán)化酶的活性，使cAMP減少。而cAMP也是乳糖操縱子表達(dá)的必需因子。這是乳糖操縱子表達(dá)的另一種調(diào)控機(jī)制。第六十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子表達(dá)中的葡萄糖效應(yīng)

cAMP可與其受體蛋白CAP（cataboliteactivatorprotein，也叫cyclicAMPreceptorprotein，CRP）結(jié)合，形成復(fù)合物，結(jié)合到乳糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域，從而使得RNA聚合酶能夠與啟動(dòng)子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。沒有cAMP－CAP復(fù)合物與啟動(dòng)子的結(jié)合，RNA聚合酶不能結(jié)合到啟動(dòng)子上。

很多操縱子的轉(zhuǎn)錄需要cAMP－CAP復(fù)合物的參與，尤其是那些－10和－35序列保守性不強(qiáng)的啟動(dòng)子。第六十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子啟動(dòng)子上

CAP與RNA聚合酶的順序結(jié)合第六十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五乳糖操縱子啟動(dòng)子上的CAP結(jié)合位點(diǎn)第六十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五CAP與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后使DNA發(fā)生彎曲第六十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期五負(fù)調(diào)控和正調(diào)控

Innegativeregulationarepressorproteinbindstoanoperatortopreventagenefrombeingexpressed.

InpositiveregulationatranscriptionfactorisrequiredtobindatthepromoterinordertoenableRNApolymer