電泳工作原理工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一，電泳是指帶電粒子在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同，有瓊脂糖凝膠電泳，淀粉凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE^于無電滲作甩樣品用量少(1-100〃g),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品，凝膠機(jī)械強(qiáng)度大，重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用.SDS是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分離蛋白質(zhì)，主要依據(jù)其分子量和電荷的差異，而SDS(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異，因為SDS的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級及三級結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后，要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時,蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化，蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子，這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷，從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計，消除了不同分子之間原有的電荷差別，其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小，這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入漠酚藍(lán)染料，漠酚藍(lán)指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時，即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)^J備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的，因而制膠之前必須首先知道這兩個參數(shù).一般可以由下述公式計算：T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+b)*100%其中:3=雙體(bis)的重量；b=單體(arc)的重量;m=溶液的體積(ml)當(dāng)分析一個未知樣品時，常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗，以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知，可參考下表選擇所需凝膠濃度:蛋白質(zhì)分子量范圍(Da)適宜的凝膠濃度(％)<10420-301X104-4X10415-204X104-1X10510-151X105-5X1055-10>5X1052-5分離膠：電泳凝膠濃度試劑10%12%15%10%12%15%H2O(ml)4.03.32.35.94.93.430%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)3.34.05.05.06.07.51.5mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)2.52.52.53.83.83.810%SDS(ml)0.10.10.10.150.150.1510%AP(ml)0.10.10.10.150.150.15TEMED(pl)444666總體積(ml)1015濃縮膠試劑濃度(5%)H2O(ml)4230%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)10.51.0mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)10.510%SDS(pl)804010%AP(pl)6030TEMED(pl)84總體積(ml)63蛋白質(zhì)的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品制備是WesternBlotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑)5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80°C中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。一：準(zhǔn)備工作：一個水浴箱，一臺超聲裝置，組織勻漿器二：需要的溶液：裂解液Laemmli樣品緩沖液三：操作步驟：1）培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：1：胰酶酶解后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450pl裂解液反復(fù)吹打。2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450pl裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4^25000g離心1小時取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100°C水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）2）組織樣品的制備：手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘觔uffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）蛋白質(zhì)的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品制備是WesternBlotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)S-80C中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。一：準(zhǔn)備工作：一個水浴箱，一臺超聲裝置，組織勻漿器二：需要的溶液：裂解液Laemmli樣品緩沖液三：操作步驟：1）培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：1：胰酶酶解后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450pl裂解液反復(fù)吹打。2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450pl裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4^25000g離心1小時取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100r水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20°C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）2）組織樣品的制備：手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘觔uffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20C存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）附：一：裂解液的制備：組織裂解液（全細(xì)胞蛋提?。?：Tris-HCL50mmoL/LPH7.42:Nacl150mmoL/L3:去氧膽酸鈉0.25%4：NP-40或Triton-x-1001%5:EDTA1mmoL/L6：PMSF1mmoL/L7：Aprotinin1pg/ml8:leupeptin卬g/ml9:pepstain1pg/ml其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。細(xì)胞裂解液：1：NP-40裂解體系：150mmoL/LNacl1.0%NP-40或Triton-x-10050mmoL/LTris(PH8.0)2：RIPA裂解體系：150mmoL/LNacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脫氧膽酸鈉0.1%SDS50mmoL/LTris(ph8.0)二:Laemmli樣品緩沖液配置(1*SDS樣品緩沖液)50mmoL/LTris-HCL(PH8.0)100mmoL/LDTT2%SDS0.1%漠酚藍(lán)10%甘油此液可以配置成不同的儲存液，根據(jù)蛋白濃度而定，40C長期保存，用時臨時與蛋白液按比例混合，其中DTT應(yīng)臨時加入，以防降解。蛋白質(zhì)定量1)Bradford法：檢測原理：Bradford與蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)，特殊氨基酸結(jié)合，由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測.該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶，去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果，如TritonX-100,SDS,NP-40等.Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml濃磷酸;然后，用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4°C至少6個月保持穩(wěn)定.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)，如果待測樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20pg-150pg/100Ml之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將待測樣本溶于100Ml緩沖溶液中，該緩沖溶液相同(最好用PBS)按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液，如果出現(xiàn)沉淀，過濾除去.每個樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液，作用5-30分鐘，燃料與蛋白結(jié)合，將由紅色變?yōu)樘m色，在595nm波長下測定其吸光度，注意顯色反應(yīng)不超過30分鐘.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的濃度.2)Lowry法：檢測原理：是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強(qiáng)蘭色形成,750nm檢測.首先，將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1gCuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液，儲存于冰箱中,可穩(wěn)定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚試劑按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/lNaOH溶液混合,室溫下儲藏,可穩(wěn)定保存2周，標(biāo)明為試劑A按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合，室溫下儲存于琥珀色試劑瓶中，可穩(wěn)定保存1個月，表明為時機(jī)B用蒸餾水將樣本(5-100pg)稀釋為1ml,并準(zhǔn)備100,50,25,12.5^g/ml,4個濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.每個蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.加入0.5ml試劑B并立即混合，在室溫下孵育30分鐘.在750nm光波長下測定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本蛋白質(zhì)的濃度.3)紫外分光光度法：檢測原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長下有最大吸光率，最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.純化蛋白質(zhì)濃度的測定:在280nm波長下讀取與適當(dāng)對照相比較的吸光值.對于抗體和BSA,可按照下述標(biāo)準(zhǔn)計算其濃度，對其他蛋白質(zhì)粗略地估計:1單位吸光值相當(dāng)于1mg/ml蛋白質(zhì)A280(1mg/ml)IgG1.35IgM1.2BSA0.7含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測定：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)SDS設(shè)備和材料電泳裝置(垂直板電泳槽)為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。電泳儀(電源)為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。振蕩器試劑丙烯酰胺(電泳級)N,N,-甲叉雙丙烯酰胺(bis)SDSTEMEDTris過硫酸銨a-巰基乙醇或DTT甘油甘氨酸漠酚藍(lán)（11）鹽酸3）聚膠前準(zhǔn)備：配制凝膠儲液：T%=30%C%=1%arc:bis=29:1過濾后4°C避光保存。配制濃縮膠緩沖液：1.0mol/LTrisHClPh6.8,過濾后4C避光保存。配制分離膠緩沖液：1.5mol/LTrisHClPh8.8,過濾后4C避光保存。配制10%SDS配制10%過硫酸銨（AP）TEMED原溶液電泳緩沖液（5X）：Tris15g+甘氨酸72g+SDS5g+H2O至1L,臨用時稀釋5倍至1XSDS電泳緩沖液加入電泳槽中。4） 制膠： 制膠關(guān)鍵是聚合時間，最好是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時間為15-20分鐘（并不是此時已凝聚完全）。對濃縮膠最佳聚合速度為8-10min開始可見聚合，可以通過調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量來控制，因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合，總之，要掌握一個原則：即用盡量少的催化劑在最佳時間聚合。按比例配制分離膠，輕緩地?fù)u動溶液（8-10下），使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置90min。同前按比例配制濃縮膠，但搖動溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制90min以上以保證完全聚合。5） 預(yù)電泳：將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時間的預(yù)電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通。6） 加樣：預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品，注意加樣時間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。7） 電泳：加樣完畢，蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳，通常在連續(xù)系統(tǒng)中，上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠，電泳時，應(yīng)采用恒壓的模式，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V，分離膠120V，電泳直至漠酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。8） 染色和脫色電泳完畢需通過染色和脫色評定其結(jié)果的優(yōu)劣.對凝膠中分離成不同條帶的蛋白進(jìn)行檢測.此外，根據(jù)不同的研究目的，也可將凝膠電印跡①考馬斯亮藍(lán)染色：將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中到如少量的染色液，以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩，直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止，一般5-6小時或者4°C過夜;然后傾去染色液，用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液，直至脫色液顏色稍清亮.，凝膠背景清楚為止.染色液配制：90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質(zhì).脫色液的配制：90mL(甲醇):H20(1:1V/V)和10ml冰乙酸溶液.附：一、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的選擇凝膠電泳中一