教習(xí)學(xué)終極目標(biāo)會(huì)用甘藍(lán)下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織誘導(dǎo)分化成小植株。

會(huì)用種子播種獲取甘藍(lán)無菌苗；會(huì)無菌操作技術(shù)

會(huì)用細(xì)胞全能性理論解釋器官發(fā)生促成目標(biāo)教學(xué)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo)快繁珍貴材料保存雄性不育材料獲得轉(zhuǎn)基因再生植株固定雜種優(yōu)勢(shì)項(xiàng)目介紹工作任務(wù)任務(wù)一對(duì)培養(yǎng)室、接種器械及接種人員進(jìn)行消毒滅菌。任務(wù)二對(duì)外植體進(jìn)行消毒滅菌任務(wù)三接種外植體，培養(yǎng)獲得無菌苗。任務(wù)四切取無菌苗下胚軸進(jìn)行培養(yǎng)。任務(wù)五對(duì)下胚軸培養(yǎng)的無菌苗進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)。任務(wù)六對(duì)甘藍(lán)無菌苗進(jìn)行馴化和移栽。

相關(guān)實(shí)踐知識(shí)-外植體接種相關(guān)實(shí)踐知識(shí)接種室的滅菌1.接種室的地面，墻壁要擦洗干凈2.接種前用甲醛10ml/m2，5g高錳酸鉀熏蒸3.接種室還可以采用紫外燈滅菌三、對(duì)接種環(huán)境、接種器械及接種人員進(jìn)行消毒滅菌超凈工作臺(tái)滅菌：1、開風(fēng)機(jī)前將紫外燈打開30min以上2、之后開風(fēng)機(jī)15min

3、用95%酒精洗工作臺(tái)面接種器皿、用具的滅菌：用具先用95%酒精浸泡后，于酒精燈外焰灼燒或使用消毒器消毒工作人員接種前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作1、個(gè)人衛(wèi)生，穿工作服2、用70%酒精擦手（一）接種原則：杜絕一切可能的污染接種前準(zhǔn)備接種室的滅菌超凈工作臺(tái)的滅菌接種器皿、用具的滅菌

材料的滅菌工作人員接種前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作四、外植體的接種和培養(yǎng)（二）防止污染與接種防止空氣污染防止操作帶來的污染防止器皿用具污染人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿：洗→熱壓玻璃器皿：洗→干熱（干熱箱）或晾干接種用具：用CCL4布擦→濕布擦→

泡75%~95%酒精→燒

培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗→化學(xué)藥劑處理內(nèi)部細(xì)菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺(tái)

用化學(xué)試劑薰蒸（甲醛或者甲醛：

高錳酸鉀=10:1)

污染來源防止空氣污染接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口使瓶口各部分都燒到，然后打開瓶口。為防止灰塵或細(xì)菌落入瓶中，瓶子應(yīng)拿成斜角防止操作帶來的污染A、整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速錯(cuò)

誤正確B、接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求錯(cuò)

誤正確C、接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口

錯(cuò)

誤正確D、瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口

錯(cuò)

誤正確接種完一瓶火燒用具或消毒器滅菌以防止交叉污染產(chǎn)生

防止器皿用具污染分布均勻外植體必須與培養(yǎng)基緊密接觸，且在培養(yǎng)容器內(nèi)均勻分布，以保證營養(yǎng)的充分利用，以及光照條件均勻一致錯(cuò)誤正確注意對(duì)象根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象采取相應(yīng)合適的接種方法，具體為：（1）種子和分生組織（2）接種莖段（3）接種帶腋芽的莖段（1）種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足。錯(cuò)

誤正確（2）接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中錯(cuò)

誤正確（3）接種帶腋芽的莖段：為促進(jìn)帶頂芽的離體莖段中腋芽的生長，最好將莖段平放在培養(yǎng)基上，可破除頂端優(yōu)勢(shì)，有利腋芽生長。

相關(guān)實(shí)踐知識(shí)-外植體進(jìn)行消毒滅菌

一、外植體的滅菌預(yù)處理：

1、組織修整

2、流水沖洗滅菌

1、滅菌要求：消滅病菌，不損傷組織材料

2、消毒劑：不損傷植物材料殺傷力強(qiáng)易被清除特點(diǎn)常用滅菌劑：升汞、次氯酸鈉、次氯酸鈣、酒精、雙氧水、硝酸銀、溴水滅菌原理自來水：除去塵土，清潔劑去掉表面垢污。酒精：70%酒精使蛋白質(zhì)失活。95%有時(shí)被用來溶解外植體表面的臘質(zhì)層。NaClO（商業(yè)漂白劑）或Ca(ClO)2：活性在于Cl-和其他氧化反應(yīng)。HgCl2活性在于Cl-和使蛋白質(zhì)失活的重金屬。潤濕劑（例如：Teepol、吐溫20）可以加到上述溶液中，提高效果。*汞對(duì)環(huán)境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一個(gè)大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀，利用虹吸管去除表面沉淀。HgCl2：Hg2＋

+蛋白質(zhì)細(xì)菌蛋白變性次氯酸鈉和次氯酸鈣：Cl-+氨基蛋白質(zhì)氧化、代謝功能發(fā)生障礙。漂白粉：CaCl2+Ca(ClO)2+H2O2Cl2+2Ca(OH)2Cl2+H2OHCl+HClO2HClO2HCl+O2表面滅菌

典型的滅菌流程材料的預(yù)處理(剪切、清洗)75%酒精(20s)0.1%升汞(15min)無菌水沖洗（6次）瀝干接種通用過程：

1、根據(jù)培養(yǎng)容器大小將材料切割成適當(dāng)大?。?/p>

2、流水（自來水）沖洗植物表面：1-2hour；

3、在酒精中晃動(dòng)幾秒鐘;4、HgCL2（0.1～1%）＋Teepol（陰離子去垢劑）2滴/100ml：3～5min5、用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水沖洗

6、商業(yè)漂白劑7～15%＋Teepol2滴/100ml：10～30min7、再用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水沖洗幾次滅菌關(guān)鍵性問題適當(dāng)?shù)臏缇鷦┐钆溥m當(dāng)?shù)臏缇鷦舛冗m當(dāng)?shù)臏缇鷷r(shí)間注意接種操作防止污染分布均勻注意對(duì)象蘭花花枝的無菌消毒相關(guān)實(shí)踐知識(shí)接種室的滅菌1.接種室的地面，墻壁要擦洗干凈2.接種前用甲醛10ml/m2，5g高錳酸鉀熏蒸3.接種室還可以采用紫外燈滅菌三、對(duì)接種環(huán)境、接種器械及接種人員進(jìn)行消毒滅菌實(shí)踐知識(shí)-外植體選擇一、外植體的選擇原則：外植體種質(zhì)優(yōu)良外植體的部位合適植株健壯時(shí)期合適季節(jié)和時(shí)間合適大小合適問題探究-滅菌方法一、滅菌的方法與原理物理滅菌化學(xué)滅菌壓力蒸氣滅菌灼燒滅菌過濾滅菌紫外線滅菌熏蒸滅菌涂抹滅菌噴霧滅菌浸泡滅菌問題探究-污染原因入防治接種后觀察細(xì)菌污染真菌污染材料內(nèi)部帶菌二、污染源細(xì)菌污染表現(xiàn)：

發(fā)酵狀水漬狀滴形云霧狀（遲緩芽孢桿菌）污染原因：

培養(yǎng)基滅菌不過關(guān)接種器具污染操作污染交叉污染真菌污染表現(xiàn)：

灰、白、黃、綠菌絲體、孢子組成絨毛狀物有色圈污染原因：

培養(yǎng)室濕度過大瓶口積落有灰塵和孢子。材料內(nèi)部帶菌在培養(yǎng)基中表現(xiàn)的癥狀

外植體接觸培養(yǎng)基部位長菌外植體損傷部位長菌外植體生長不良或表現(xiàn)出缺綠診斷培養(yǎng)基添加有機(jī)物檢測(cè)細(xì)菌在培養(yǎng)過程中我們沒有辦法做到與細(xì)菌完全隔絕。有時(shí)細(xì)菌感染的癥狀可以在植株或培養(yǎng)基上觀察到。通?？梢姷陌Y狀出現(xiàn)在培養(yǎng)后期，或是在繼代幾次后才出現(xiàn)。它們也可能不完全出現(xiàn)，但在馴化期早期會(huì)造成一些困難。并非所有的細(xì)菌都是致病，甚至有些是有益的。

組培中常見的一些細(xì)菌

農(nóng)桿菌3%桿狀菌13%腸桿菌12%假單胞菌19%乳酸菌11%葡萄球菌26%傳染性細(xì)菌癥狀

(left:nobacteria;rightcontaminated)真菌真菌感染主要來源是：表面滅菌不充分轉(zhuǎn)移操作過程中的污染真菌孢子隨微小的東西或牧草蟲傳播真菌污染可以輕易地用肉眼觀察到。檢測(cè)支原體比較困難，因?yàn)樗鼈儾灰着囵B(yǎng)，所以鑒定也非常不容易。支原體小型節(jié)肢動(dòng)物和牧草蟲

很多實(shí)驗(yàn)室都可見到小型的節(jié)肢動(dòng)物或牧草蟲。這是一個(gè)主要的問題。雖然這些生物是無害的，但它們會(huì)傳播真菌孢子及細(xì)菌，從而給培養(yǎng)造成困難。Thrips（牧草蟲）Mites螨肚子充滿卵的雌螨螨類的真菌性污染fungalcontaminationbymites如何應(yīng)對(duì)？細(xì)菌:抗生素真菌:適當(dāng)殺菌，避免小型節(jié)肢動(dòng)物及牧草蟲支原體：支原體消除劑小型節(jié)肢:噴霧殺蟲劑項(xiàng)目小結(jié)1.植物組織培養(yǎng)的成敗除與培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的正確選擇有關(guān)外，還與外植體本身有關(guān)，選擇外植體時(shí)應(yīng)考慮植物的基因型、生理狀態(tài)、取材季節(jié)、取材部位等。2.外植體消毒一般采用消毒劑浸泡法（即植物材料預(yù)外理、70%酒精浸泡、消毒劑浸泡、無菌水沖洗），如果外植體污染嚴(yán)重，還可以采用多次消毒