實時定量ＰＣR應用中的問題及優(yōu)化方案聚合酶鏈式反響〔poｌｙmeｒasechainreａｃｔiｏｎPCR)自誕生之日起就打算了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法,而且也是一個能對核酸分子進展準確定量的有力工具[1],定量ＰCR技術取得了突飛猛進的進展，不僅建立了一系列的方法,而且也誕生了很多與這些方法相匹配的PCR〔real-timequaｎtitａｔiｖePCＲ)技術便是一種PCＲ是指在ＰCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量[２]。目前它作為一個極有效的試驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學爭論的各個領域，僅2023-2０01年,收錄在Medliｎe上的以ｒeal-timeＰCR為關鍵詞的文章就達一千多篇。PCＲ技術較之與以前的以終點法進展定量的PＣR它不僅操作簡便、快速高效,而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進展實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進展操作。另外,它還可以通過不同的引物設計在同一反響體系中同時對多個靶基因分子進展擴增，［３，４,5P及試驗條件的優(yōu)化作一綜述。實時定量PＣR的應用現(xiàn)狀年誕生以來,由于它顯著的優(yōu)越性，不僅廣泛的應用于分子生物學的各個爭論領域,而且也開頭作為一種診斷手段應用于臨床。其應用涉及到的[3。Ｇiuｌietti等人[6]PCＲ測定細胞因子基因的表達作了具體的描述。細胞因子是一種調整蛋白,它對免疫反響、炎癥反響具有重要的調整作用，其量的轉變常常與一些疾病,如炎癥反響、自身免疫性疾病、移植排斥有親熱的關系。由于所得到組織樣本常常由于太小而不能滿足在蛋白質水平的檢測，另外,通常用的蛋白質檢測方法〔如ELISA)的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測,所以應用PCＲ定量進展基因診斷就顯得格外有意義。PＣR技術是對基因表達變化分析的兩種關鍵Raｊｅｅvａn等人[7]PCR技術卻成功地將基因表達的變化進展了量化,不僅有效地證明白上述兩種方法的有效性，而且供給了一種具有高通量的對基因表達變化進展檢測的技術。Lａird和他的同事們［8]MethyCｐGPCR的敏感性和特異性,使得這種方法對胞嘧啶的過度甲基化常常具有極高的靈敏度。最近有爭論說明這種方法可以從食管癌病人的食管粘膜中檢出含有發(fā)生了過度甲基化基因的細胞[9Sevａll１0]證明可以用實時定量ＰＣＲ方法區(qū)分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報告基團標記Ｔａqman探針，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發(fā)生雜交，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交打算的，所以假設消滅一種信號強于另一種信號則說明兩條基因具有同源性，假設兩種信號都增加則說明為異源性。目前實時定量ＰCR在臨床診斷方面的應用主要表達在對感染組織或細胞負載病毒和RNＡ病毒都可以檢測目前已有標準的操作手冊供人們使用,但是必需明確，國際上既沒有統(tǒng)一的病毒荷載的標準，也存在著對其標準曲線和定量準確性的各種爭論。這里值得一提的是一種稱為NASBA(nuｃｌeｉcaciｄseqｕ的技術[1１］,它是一種利用電化學以光的等溫PCR反響,術 ,這種方法常常用于對逆轉錄病毒的定量測定。常用的熱循環(huán)儀重要的緣由就是的熱循環(huán)儀的研制與推廣。目前，國內外常用的熱循環(huán)儀主要有以下幾種:PE公司生產(chǎn)的ＡpplｉedBioｙstem(1)ＡＢIＰrisｍ7700SequｅnceSｙsteｍ(ＳDＳ)PCR測定儀，它由激光激發(fā)熒光,并且可在５00-６60nｍ范圍內調整波長,DNA結合beacon96個樣本,并且速度較快，一批樣本的完2小時。但是它不能實時對擴增結果進展分析，而只能在全部擴增完畢后才進展數(shù)據(jù)分析。(２)ＧｅnｅAmp5７00SDS:它的根本工作原理和操作與ABIPrism7700SDＳ一樣,但是它是利用鹵素燈為激發(fā)光源，而且只設計了一個檢測波長。(3)ＡBIPrism7900ＳDＳ:這是一種為實現(xiàn)高通量檢測而設計的儀器,其根本構成與AＢＩPrism77０0SDS,而且有兩種樣品盤可供選擇(9624ｈ84384孔板的樣本測定。ｉghtｃycｌer熱循環(huán)儀,20-２5ul的毛細硅管作為反響管進展擴增，光源選用冷光源系統(tǒng)，可以削減光源對樣本的影響。由二極管放射藍光激發(fā)熒光,并供給三個濾光片，可利用熒光分光測定的原理，同時對一個反響體系,PＣRLｉghｔｃycｌer使用了其獨特毛細管反響體系和空氣快速熱循環(huán)系統(tǒng),使樣本能在格外短的時間內有效地實現(xiàn)溫度變化,20-30mｉn內快速完成３0-40[12]LｉｇｈtｃycleｒSＹBRIGrｅenITａｑman熒光探針和雜交探針。雖然Liｇhtｃycleｒ有相當多的優(yōu)點,但是這也有一些缺乏之處，由于它只供給一32孔的樣品盤,這使得不能在一次進展較多的樣本測定。Ｂio-rａdiCyｃlｅriQ：這種儀器供給連續(xù)的檢測波長調整，程序96個樣本的測定，所以能供給相對較快的擴增反響。MX４０00Mｕltiplｅx:這種儀器的檢測波長可在３5０雜交探針和分子信標(ｍolｅcｕlarbeacon〕,其樣品盤的規(guī)格有多處可供選擇，包括96孔盤、８聯(lián)管或單管，其程序也供給實時數(shù)據(jù)分析。CepheiｄSmartCyｃleｒSystｅm：這種儀器正如其名一樣具有強大的功能,它有１6種反響模式可供選擇,而且每種模式都有各自的程序,任一模式不僅能同時檢測四種熒光信號,SｍartＣｙcｌerSystｅｍ的這種設計雖然有其優(yōu)點，但是其缺點也是顯而易見的,由于其將樣品盤分得過細，所以不利于同時進展較多樣品的分析。CorbｅｒtRｅsearｃhRoｔoｒ-Geｎe:這種儀器與Ｌightcycler相比,屬于〔372孔〕供選擇；可以對多種熒光材料進展測定。熒光材料進展為了滿足實時ＰCR更高敏感性要求，各試劑公司都致力于開發(fā)型的化學發(fā)光材種:水解探針或Taｑmaｎ探針：這種探針用于Tａｑmaｎ分析法，它能被DＮA合成酶(例如Taq酶)的5’ 3’活性所降解,探針的５’端有一熒光報告基團，3’端有一熒光淬團當兩個基團相互先靠近的時候由于發(fā)生能量傳遞作用,報告基團不能發(fā)出熒光，但隨著擴增反響的進展,５’端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來,不再與淬滅發(fā)生能從而能發(fā)出熒光,被信號探測器所捕獲。常同探針5’端相結合的基團有FＡM〔6-羧基熒光素〕,TET(四氯－6－羧基熒光素〕,JOE(２,7－二甲基-4,５-二氯-６－羧基熒光素),HEX(六氯－6－甲基熒光素)或VIC,常與3’端相結合的熒光淬滅基團常為〔6-羧基四甲基假設丹明)或DABCYＬ(４-(4’-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸。相較之于TＭA使用DABCYＬ可以更有效的削減自發(fā)熒光信號[６。目前，水解探針已被用于基因檢測[13]、病毒定量[1４,15]、癌細胞基因微突變檢測[16]、細胞因子基因定量［17］等，其結果都具有高特異性與高敏感性。:DNA形成的發(fā)夾構造,有一淬滅基團[１８］,當它形成發(fā)夾構造時,由于熒光報告基團與淬滅基團想互靠近，兩者之間發(fā)生熒光信號能量共振轉移(fｌuｏresｃeｎｔresｏｎanceenergytransferFＲET),當bｅacon的解鏈溫度時，其構象發(fā)生轉變，能與模板結合而完全伸,ＲET消逝,報告基團發(fā)出熒光信號［19,2０DN的寡核苷酸探針高[２1，２2]beacｏｎ已被用于突變檢測[23,２4]、病原體定量[２５,26]、病毒檢測[2７]和胚胎的性別推斷[28],它同時出用于PCR檢測逆轉錄病毒［2９]。scorpions:,但是此探針也具有引物的功能[30]。引物與形成發(fā)夾構造的探針相連，在探針上由于熒光報告基團與淬滅基團相互靠近,不能放射熒光。在反響的變性階段，探針的發(fā)夾構造會解,,報告基團同淬滅基團分別而放射熒光。同Tａqman探針和分子ｂｅaｃｏn相比，scorpioｎ能更快地放射出熒光且信號更為猛烈[3１］,其特異性也很高,-引物才會與之相結合。Scorpioｎ是一種較的熒光材料,具有良好的應用前景［31]。雜交探針：該材料使用四個寡聚核苷酸分子,兩個引物與兩個探針，雜交探針分別單標，一個攜帶熒光供體基團，一個攜帶熒光受體基團,當這兩個探針雜交到目的基因上RET使得供體基團在不同波長條件下被激發(fā)，放射出的熒光量直接與目的基因的產(chǎn)量成相關關系[3２]RｏcheLｉghtcyｃlｅr所應用,進展病原體檢測[33]、病毒荷載量［34]的測定等領域。５. SYBRGreｅｎI:這是一種DNA結合染料,能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后,便可以發(fā)出熒光［３5]。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相協(xié)作，用于任意反響體系中，從經(jīng)濟角度考慮,它也比其它的探針的價格要廉價得多,但由于它能與全部的雙鏈DＮＡ結合,所以一旦反響［3６LigｈtcｙcｌerRotoｒgｅne、Smarｔgeｎｅ等熱循環(huán)儀內設定的程序過對擴增曲線進展分析,以區(qū)分由ＰCＲ產(chǎn)物和本底造成的熒光信號，另一方面就是選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反響條件以消退非特異性影響[3７]。實踐中的問題：PＣR已廣泛地運用于分子生物學的各個領域，就目前的應用狀況來看,雖然取得了很好的效果,但是其在方法學上的選擇、敏感性問題、重復性問題等都始終是爭論不休的，本文將就這些問題做出探討。方法的選擇:的基因的表達差異有直接的反映[38。確定定量最為簡潔的方法就是標準曲線法，用一系列濃度的標準品制作標準曲線,在同等條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進展比較,從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質粒ｄsDNＡ,體外轉錄的RNＡ，或者是體外合成的ssDＮＡ[39]。目的基因與標準品在不同的反響管內同時進展擴增，SYBRGreenI。有爭論說明[40]，這一方9個數(shù)量級，遠比終點法的要高。這一方法雖然簡便，但是為了得到牢靠的試驗結果,,一是所選用的標準品必需與目的,需要標準品同目的基因的同源性盡可能的高,不僅相像,而且其堿基組成也盡量一樣;二是要盡可能地優(yōu)化試驗條件和模板的預備過程。就標準品而言,實踐中有外參照和內參照之分,作為外參照的標準品與目的基因不在同一反響體系中進展擴增,所以它無法檢測也不行能補償可能消滅在目的基因反響體系中的影響因素,如ＰＣR抑制子[４1]。事實上,在絕大多數(shù)的試驗中,要想使標準品和目的基因的擴增效率完全全都是不行能的。為了彌補單獨使用一個標準品作為外參照的缺乏,爭論者便引入一個內參照同目的基因在同一反響體系中同時進展擴增，以反映體系中可能消滅的素,此即所謂的競爭性PＣR競爭性ＰCR所使用的內參照具有與目的基因序列一樣的引物結合位點但不具有一樣的探針結合位點[4２關于內參照的設,有多種方法可供選擇例如向目的基因序列中引入插入或缺失突變［43轉變目的基因中的某些核苷［44設計不同的限制性酶識別位[45]也可以用非特異的間隔基因或間隔DNA 作為內參照[46。競爭性ＰCＲ設計的原理在于內參照與目的基因相互競爭反響的原料,所以兩者的量應當相互匹配，假設一方的拷貝數(shù)大大的高于另一方，那么拷貝數(shù)多的一方就會在反響體系中得到優(yōu)先擴增，而拷貝數(shù)少的一方則擴增受到抑制,定量也就不能有效地進展由于使用了內比照,所以一旦體系中存在干擾PCR擴增的因素就會通過內比照效率的變化反映出來,目前使用的實時定量ＰCR儀都是以擴增曲線上crosｓingpｏint的漂移來表達擴增效率的變化的競爭性PCR 由于能夠消退反響體系中干擾因素的影響,所以它所等到的結果要準確牢靠得多,但是由于在反響體系中同時擴增兩種模板,使得其結果的測定范圍比單使用外參要大為縮小，往往只有2-3個數(shù)量級[４0]。正是由于有利有辟,所以爭論者應依據(jù)不同的狀況打算是否使用內參照。在目前的爭論中大多數(shù)爭論者選擇使用確定定量的方法,但是也有學者［47]認為在當前的條件,確定定量具有難以抑制的缺陷,主要包: 1制作一系列稀釋濃度的標準品不僅費時費力,而且也有相當多的問題，目前廣泛使用的在260ｎｍ波長下定量的方法與眾素有關,如水、緩沖液、儀器性能,乃至于核酸的抽提過程都會影響到結果的穩(wěn)定性。(2〕標準品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質易于被降解,而每次配制的標準品又會增加批間差異〔3〕每次測定樣本都要同時測定標準品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內測定更多的樣本,這樣也就使實時PＣR的高通量有所降低〔4〕由于樣原來源存在極大的差異,所以很難保證標準品與目的基因的擴增效率全都板片斷不均一,都會對定量的結果造成很大的差異。鑒于以上緣由，這些學者猛烈地推舉使用相對定量的方法，所謂相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內源性管家基因,該管家基因的作用有〔1)用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較;〔２〕作為內源性比照補償待測樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異,以及反映反響體系內是否存在ＰCR擴增的影響因素;(3)標準化標本[4７]。由于管家基因在各種組織中是恒定表達的，所以可以以管家基因的定量來作為某種標準以比較樣原來源不同的目的基因表達量的差異。具體的需要而選定適宜的管家基因。使用的相對定量較為早期的方法是用一系列外參物做標準曲線,,再將目的基因的同管家基因的比值作為定量的最終結果。這一方法要求外參、目的基因和管家基因的擴增效率全都。除了這種常用的方法之外,LｉｖaｋSｃhｍiｔｔgen[４8]設計了一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達,他們依據(jù)數(shù)學推導得出目的基因的量=2-^^Ct,在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測到反響體系中熒光信號的強度值，ΔΔCt=(Ｃt,目的基因－Ct,管家基因〕試驗組-(t,－Ct比照所以,2-^^Ct表示的是試驗組目的基因的表達相對于比照組的變化倍,而不必制作標準曲線,所以這一方法更為簡便省時。統(tǒng)計學結果說明這一方法的結果也是相當牢靠的。和準確,由于存在于反響體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑影響等都可以通過數(shù)學處理而去除。重復性問題:,其主要推斷指標為標準差(SＤＣ,PCR反響能檢測出樣本中目的基因的初始濃度變化的最小值。由于ＰＣＲ反響本身具有不準確擴增的特性,它所造成的結果準確性要遠小于經(jīng)典的臨床化學檢驗和免疫分析。對于絕大多數(shù)試驗，一般都可以計算出所設計體系能檢測出樣本初始濃度的最小值,依據(jù)屢次試驗可以求得該最小值的變異狀況和它的可信區(qū)間范圍，變異越小或是可信區(qū)間范圍越小,說明這一反響體系PＣR過程中，從樣本的預備到擴增，再到定量的進展,試驗中的每個方面都與試驗的重復性息息相關，除了加樣的準確性和試驗所選用的儀器固定〔1〕ＰCR反響擴增的效率，假設在反響體系中擴增效率不全都,就會影響到目的基因在單位時間內的產(chǎn)量發(fā)生差異，從,必需盡量優(yōu)化試驗條件,使反響體系到達最正確擴增效率。(２〕目的基因的初始濃度,初始拷貝數(shù)越低,結果的重復性越差,為了保證獲得準確的結果,,假設待測樣本中目的基因的量處于反響體系的檢出限四周,〔3)標準曲線的影響,對于必需進展確定定量的爭論,標準曲線是必不行少的，雖然標準品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個好的標準曲線對定量結果至關重要，在制作標準曲線時,應至少選擇5個稀釋度的標準品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能消滅的全部濃度范圍，抱負的標準品應與樣本具有高同源性,最好是選擇純化的質粒ＤＮAA(用R-PCR作手冊進展。３.敏感度問題：實時定量PＣR由于使用了熒光物質作為定量的工具,使得其敏感性又大大地提高了，有人［４7］報導實時定量PCR的敏感性要高出傳統(tǒng)的終點定量ＰＣ250倍。在理論上，只要設計的引物對目的基因有足夠的特異性，PCR應可檢測出只含一個拷貝目的基因的樣本,也確實有人報導在特定的反響條件下,實時定量ＰCＲDN[1DＡ而言，pgfg,10２-10３拷貝數(shù)以上［8PCR,除了對一般ＰＣR反響均存在的影響因TａqPCR還有其特別的影響因素,包括:(1)反響體系中形成的引物二聚體的影響:引物二聚體是非特異性退火和延長的產(chǎn)物，它的形成不僅會影響到擴增的效率,而且由于SＹBRGreenI可以與全部的雙鏈DＮA結合,BRGｒｅｅnＩ的現(xiàn)象,從而降低了實時PＣR的敏感性。要解決這個問題，有多種方案可供選擇,首先可以用水解探針代替SYＢRGreenI，雖然水解探針并不能消退引物二聚體的形成，但是在定量檢測時它卻可以避開引物二聚體的干擾,專一地測定來自于特異產(chǎn)物的熒光信號,有文獻報導使用水解探針的敏感性要比ＳYBR Ｇreｅn I高出１0倍其次可以使用熱啟動方法，所謂熱啟動是指在反響體系到達引物退火溫度時才參與某一反響成分，由于引物二聚體的是在各種試劑一經(jīng)混合便開頭形成的，所以用這種方法能有效地削減引物二聚體供給一種Tａq酶的抗體，在PCR反響的最初階段,這種抗時,它便失活,使Taｑ酶開頭發(fā)揮作用，目的也就是使要在反響到達較高溫度時,才開頭PCＲ擴增，從而避開反響初始階段引物二聚體的形成。第三，要盡可能地優(yōu)化引物設計，例如所設計的兩條引物不能互尤其在3端使兩條引物的Ｃ含量大致全都使用純化的引物進展試驗等,這些都是防止引物二聚體形成的根本因素第四假設反響體系中消滅ＰCR的抑制因素,應適當將目的基因的濃度稀釋后再進展擴增最終,在試驗過程中應當留意避開室溫混合各種試劑,并且在一經(jīng)混合后馬上開頭進展擴增。:PＣR2５-30個循環(huán)便可獲得滿足的結果,但是對于那些極微量的待測樣本而言，適當增加循環(huán)數(shù)可以提高反響的檢出限，有文獻報3４個循環(huán)時,實時定量ＰCR106增加到１03。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多,其敏感性就會越高,實際上,當循環(huán)數(shù)增加到某一值時,敏感性便不再上升,由于循環(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素,而且在試驗過程中,也不行能由于增加敏感性而無限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實踐中行不通，而且在理論上也不行行，由于隨著循環(huán)數(shù)的增加,一方面，聚積的產(chǎn)物會抑制Ｔaq酶的活性,另一方面,也會增加形成異源二聚體的可能性，這些都會影響到最終的定量結果。CR3ｍMM2濃度對敏感性的影響主要存在于兩方面,首先，Mg2+是影響Ｔaｑ酶活性的關鍵因素,假設Mｇ2+的濃度無法到達;其次，Mｇ2+的濃度過高,會Mg2+濃度條件,是相當重要的。試驗方案優(yōu)化:由于各家公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀供給的各種試驗方案不太全都，所以優(yōu)化的策略也不盡一樣,然而在各種方案中,前文所述的那些影響實時ＰCR 素卻總是相通的。只要能較好地把握試驗條件，優(yōu)化試驗步驟，要想獲得滿足的試驗結果并不愿定都是困難的。下面本文將就影響到試驗結果的一些根本參數(shù)和試驗步驟談一談關于實時定量PCR的優(yōu)化。１.根本參數(shù)的優(yōu)化:的濃度在的濃度對影響酶的活性是至關重要的,不僅如此，適宜的MgＣｌ2的濃度還能在反響中得到較低的Cp(ｃｒossingｐｏｉnt)值,較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應慎重。一般來說，對反響,應選擇２－５ｍM濃度的ＭgCl2,mRNA為模板的ＲT－PＣR而言,則應選擇的濃度為４－8mM。模板的濃度:假設爭論者是進展首次試驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進展試驗,以選擇出最為適宜的模板濃度假設條件困難也至少要選擇兩個稀釋度(高和使Cp位于15-30個循環(huán)比較適宜,假設大于3０則應使應選擇較低的模板深度。對于Ｃp值確實定，閱歷上是SＹBRＧｒeen I探針的熒光信號比本底高２倍,雜交探針的熒光強度比本底高0.３倍。SYBRGreｅnIDNA時的條件優(yōu)化:MgCl的濃度:2－4mＭ。２,50nｇ-5pg之間選擇,質粒DNA在1０^6拷貝數(shù)左右選擇。PCR抑制子:,抑制子的濃度高,而模板量少,稀釋法就不再能到達好的效果,反會使反響的敏感度降低,所以,PCR爭論，最好選用純化的模板。PCＲ反響的關鍵因素,其濃度太低，會致,假設引物太多,PCR是個適宜的濃度,ｕM之間進展選擇，直至到達滿足的結果。2.6Tm值小5℃,然后在1－２℃Tm值有較大的差距。用ＳYBRＧreｅｎI進展一步法ＲＴ-PCR的條件優(yōu)化:MgCl的濃度:不同的靶分子選用不同的濃度,通常是在４-８mM之間選擇。２3．２模板的濃度:RT－ＰCRRNA,又可以選用ｍRNＡ，其濃度MalternatｉveRＮA作為載體進展測定。３.3比照設置：每一引物都應設有陰性比照,陽性比照和污染比照。.DNA的濃度:在２－４mM0.5-1.0mM,2.0mＭ。雜交探針的濃度：初次試驗每個探針用0．2ｕM，假設信號強度達不到要求，可0.4uM。設陽性比照。其它的條件同SＹBR GｒｅeｎI。5用雜交探針實時定量ＲT－PCR:gCl24－８mM之間進展選擇。5.:初試驗用0.２uM，假設熒光信號強度缺乏，可以增加至0．4uM。:1ｐg-1ug的總RNA或是mRＮA,假設是模板的濃度過MS2或ａlternatｉｖeRＮＡ作為載體。5.4比照設置：每個引物都要設無模板比照,陽性比照以及污染比照。-探針二聚體的形成,主要是由于探針可與引物的3’末端雜交,其形成以后,會致使此二聚體擴增,從而同目的基因競爭反響的原料，致反響,且其解鏈溫度高于引物,所以它可能作為3’末端完全磷酸化，使之不,,從而干擾試驗結果。鑒于以上這兩點，所以應對探針細心設計，并將其末端完全磷酸化。目前的實時定量PCＲ技術進展快速,本文是結合本試驗室的工作閱歷以及文獻資料寫成的，文中提到的一系列方案、試驗材料和儀器設備都有其各自的優(yōu)缺點，也有各自,,都應依據(jù)自己的狀況首先找到適合自己爭論目的的條件,PＣR進展爭論的人員參考。參考文獻：Eｎzymatiｃamplｉfｉcatiｏnofｂetａ-ｇlｏbｉngenomicseｑｕencesandrｅstｒicｔｉoｎsiteanalyｓisfordiagｎoｓisｏfsickleｃellaneｍia.Scｉencｅ1985.23０：１35０-135４.Montｏgｏｍerｙ，R.Ａ，aｎｄDallman,M.J１9９7Cｙtokｉne9,７１7－7２6.WallSJ，ＥdwａrdＤR.Ｑuantitativereｖeｒsｅtransｃrｉptiｏn-pｏｌymerasechaiｎreacｔion(TＲ-PCR):Acoｍparisonoｆpriｍｅ－dｒoppｉng,ｃompｅtitiｖe,andrｅal-tｉmeＲＴ-ＰＣＲs.AｎaｌBioｃhem.２002Ｊaｎ15;300(２)：26９-７3.SｃｈmittgｅnTD．Rｅal-tiｍeｑuａntｉtａｔivePCR.Ｍeｔｈｏds.２001Ｄｅｃ;２5(４):383-５.WillaｒdM,Freｅｍan,SｔephenＪ.ＷａlkeｒandKentＥ.Ｖrａna．QuantitatiｖｅRT-ＰCR:PitfａlｌａndPotｅｎtｉal．ＢiｏTｅcｈｎｉqｕes９99Jan26(１：112-２5.GiｕｌiｅｔtiＡ，OvｅrbｅｒgｈＬ,ValckxD,DecａllonneB，BouiｌｌonR,Mａt(yī)hieuC.Anoverviewofreal-timequaｎｔitatｉｖePCＲ:apｐlicatiｏntoquantifｙcytokinegｎeexｐrｓsiｏn.Ｍｔhods２00１Ｄｃ；２5(４：３８6-401.RajeｅｖanMS,RａnamukhaaraｃｈchｉDG,ＶernonSD,UnｇeｒER.Useoｆreal-tiｍｅquantitatｉvePCRtovａlｉdateｔｈeresulｔsofcDNAarｒaｙandｄifｆｅｒentｉａｌdiｓplａyＰCＲtecｈnoｌogieｓ.MethoｄsDｅｃ2５(4〕:４4３－5１．LivarkK.J.,ａｎｄＳchmｉttgｅｎT．D.20０1Mｅtｈｏds2５，４02-４0８．BrａｂｅｎdｅrJ,LｏｒdＲ,ＧroshenS．2023J.Ｎatｌ.CaｎｃerInsｔ.92,1８０5-1８11.MetＵｌrｉｃhL.,anｄHansＫ.Real－ｔimePCRanａlysｉｓoｆDNAaｎdRNAeｘtraｃｔedfroｍformａlin–fiｘedandparaffin－embeddedbｉopsiｅs.2023Meｔｈods2５，409－418．LeoneG．,vanSｃhijnｄelH.,vaｎGemeｎＢ.,ＫｒamerF．R.，aｎdSｘhoeｎＣ.D.1998NuｃｌｅｉcAcidsＲｅｓ.2８，655－６６1．WｉｔtwerCT,RirieKM,AndreｗRV,DavidＤＡ,GuｎdryRＡanｄBaｌisＵＪ.199７Biotecｈｎiques221７8-1８3.KiｌlgoreＧE,HolｌoｗａyB 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