第一課外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)原理及微量移液器的使用演示文稿當(dāng)前第1頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)（優(yōu)選）第一課外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)原理及微量移液器的使用當(dāng)前第2頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)第一部分外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)原理研究者經(jīng)常需要獲得大量的蛋白質(zhì)以滿足各類研究的需要。比如：1，用作抗原來刺激抗體的產(chǎn)生：可以是蛋白質(zhì)或其部分片斷。2，用于生化和細(xì)胞生物學(xué)研究：這種情況下保持蛋白質(zhì)原有的功能（如高比活性酶、結(jié)合蛋白或生長(zhǎng)因子）就顯得十分重要。3，用于結(jié)構(gòu)研究：要求得到的蛋白質(zhì)有天然的結(jié)構(gòu)。因?yàn)閹缀醪豢赡苤酪环N尚未知道其結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)經(jīng)變性后是否被精確地重折疊，蛋白質(zhì)必須以可溶性形式產(chǎn)生。當(dāng)前第3頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)獲得目的蛋白的方法：從天然產(chǎn)物中純化利用基因工程方法表達(dá)基因工程蛋白質(zhì)表達(dá)的概念：是指為了獲取大量的目標(biāo)蛋白而進(jìn)行的有目的的蛋白質(zhì)合成。方法是將編碼所需蛋白質(zhì)的基因插入質(zhì)粒或其他載體，然后再將載體導(dǎo)入活細(xì)胞。利用宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系產(chǎn)生目的蛋白。當(dāng)前第4頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"WernerArberDanielNathansHamiltonO.Smith

SwitzerlandBiozentrumderUniversit?t

JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine

Baltimore,USAJohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine

Baltimore,USA1929-1928-19991931-當(dāng)前第5頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)啟始復(fù)制子（ori,Originofreplication)；多克隆位點(diǎn)(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：當(dāng)前第6頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第8頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程示意圖當(dāng)前第9頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)當(dāng)前第10頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)各種表達(dá)系統(tǒng)

原核表達(dá)系統(tǒng)：指大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。真核細(xì)胞系統(tǒng)包括：哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞等表達(dá)體系。各種表達(dá)體系各有優(yōu)缺點(diǎn)。舉例說明如下：原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)載體：包括噬菌體載體和質(zhì)粒載體，通過感染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生目的蛋白。原核細(xì)胞系統(tǒng)主要是利用大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白。優(yōu)點(diǎn)：該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、周期短、收益大、及表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定。局限：表達(dá)基因的相對(duì)分子質(zhì)量有限，且不能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一些翻譯后加工、修飾。當(dāng)前第11頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)各種表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將外源基因插入昆蟲桿狀病毒，通過重組病毒感染昆蟲細(xì)胞而產(chǎn)生目的蛋白。優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)效率高，昆蟲細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工的方式與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接近。缺點(diǎn)：操作比較繁瑣。當(dāng)前第12頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)各種表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)利用病毒、質(zhì)粒建立重組有外源基因的表達(dá)載體，通過感染或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)目的蛋白。優(yōu)勢(shì)：能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)分子。缺點(diǎn)：表達(dá)效率通常不高。當(dāng)前第13頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌里表達(dá)外源基因一般是始于將基因插入表達(dá)載體（通常為質(zhì)粒）。表達(dá)載體應(yīng)具有的幾種元件是：選擇標(biāo)志的編碼序列，它可提供篩選以確定載體是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列：可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子（如lac,tr或tac啟動(dòng)子），經(jīng)誘導(dǎo)后可產(chǎn)生大量的目的基因mRNA；轉(zhuǎn)錄終止子。翻譯調(diào)控序列：一個(gè)位置合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（和起始密碼子ATG之間有合適的距離）。一個(gè)由多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)構(gòu)成的克隆位點(diǎn)，便于將外源基因以正確的方向插入載體中。當(dāng)前第14頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體（質(zhì)粒）制備感受態(tài)大腸桿菌將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA定量當(dāng)前第15頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體擴(kuò)增目的基因PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。RT-PCR方法：從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。純化PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物定量當(dāng)前第16頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體將表達(dá)質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶（與目的基因PCR引物相同的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行酶切回收質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物（載體大片段）質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物定量PCR產(chǎn)物酶切回收PCR產(chǎn)物的酶切片段PCR產(chǎn)物的酶切片段定量利用連接酶連接質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物及外源基因酶切片段當(dāng)前第17頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程重組表達(dá)載體的鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌抽提重組質(zhì)粒并定量通過酶切初步鑒定重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒（檢查目的基因插入方向、序列及閱讀框架的正確性）當(dāng)前第18頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)制備宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)帶有重組表達(dá)載體的大腸桿菌誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)當(dāng)前第19頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物抗體鑒定生物活性鑒定序列測(cè)定當(dāng)前第20頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)第二部分微量移液器的使用一個(gè)完整的移液過程包括：容量設(shè)定安裝移液頭預(yù)洗移液頭吸液排液卸去移液頭每一個(gè)步驟都要遵循操作規(guī)范。當(dāng)前第21頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)容量設(shè)定從大值調(diào)整到小值時(shí)，剛好即可。從小值調(diào)整到大值時(shí)，需要調(diào)超過三分之一圈后再返回，這是因?yàn)橛?jì)數(shù)器里面有一定的空隙，需要彌補(bǔ)。不要將按鈕旋出量程，這將導(dǎo)致移液器損壞。吸液頭安裝正確的安裝方法是：把白套筒頂端插入吸液頭，在輕輕用力下壓的同時(shí)，把移液器按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)180度。切記用力不能過猛，更不能采取剁吸液頭的方法來進(jìn)行安裝，那樣做會(huì)對(duì)移液器造成不必要的損傷。當(dāng)前第22頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)預(yù)洗吸液頭安裝了新的吸液頭或增大了容量值以后，應(yīng)把需要轉(zhuǎn)移的液體吸取、排放兩到三次。這樣做是為了讓吸液頭內(nèi)壁形成一道同質(zhì)液膜，確保移液工作的精度和準(zhǔn)度，使移液過程具有重現(xiàn)性。其次，在吸取有機(jī)溶劑或高揮發(fā)液體時(shí)，揮發(fā)性氣體會(huì)在白套筒室內(nèi)形成負(fù)壓，從而產(chǎn)生漏液的情況，這時(shí)就需要我們預(yù)洗四到六次，讓白套筒室內(nèi)的氣體達(dá)到飽和，負(fù)壓就會(huì)自動(dòng)消失。當(dāng)前第23頁\共有25頁\編于星期三\8點(diǎn)吸液先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸液頭垂直浸入液面。盡量避免吸液頭浸入液面過深，以免液壓對(duì)吸液的精