鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗主題內容與適用范圍本標準規(guī)定了Ames試驗的根本技術要求。本標準適用于檢測環(huán)境有害物質的致突變作用。原理鼠傷寒沙門氏菌的突變型(即組氨酸缺陷型)菌株在無組氨酸的培育基上不能生長，在有組氨酸的培育基現(xiàn)型)，因而在無組氨酸培育基上也能生長，故可依據(jù)菌落形成數(shù)量，檢查受試物是否為致突變物。某些致(PCB)誘導的大鼠肝勻漿(S－9)制備的S－9儀器試驗室常用設備。低溫高速離心機，低溫冰箱(－80℃)或液氮罐，干凈工作臺，恒溫培育箱，恒溫水浴，蒸氣壓力鍋，勻漿器等。培育基制備及試劑的配制4℃不超過六個月，其他詳見下述各培育基及溶液說明。養(yǎng)分肉湯培育基牛肉膏 2.5g胰胨(或混合蛋白胨)5.0g氯化鈉 2.5g磷酸氫二鉀(KHPO·3HO)1.3g2 4 2蒸餾水 500mL加熱溶解，調PH7.40.103MPa20min養(yǎng)分肉湯瓊脂培育基：用作a.基因型鑒定的結晶紫敏感試驗，抗氨節(jié)青霉素和四環(huán)素試驗，紫外線敏感性試驗。b.細菌活力鑒定。瓊脂粉 1.5g養(yǎng)分肉湯培育基 100mL加熱溶化后調pH7.4，0.103MPa20min底層培育基所需試劑及配制方法如下：磷酸鹽貯備液磷酸氫鈉銨(NaNH4HPO4·4H2O) 17.5g檸檬酸(C6H8O7·H2O) 10.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4) 50.0g硫酸鎂1)(MgSO4·7H2O) 1.0g100mL，0.103MPa20min注：1)待其他試劑完全溶解后再將硫酸鎂緩慢放入其中連續(xù)溶解，否則易析出沉淀。40%葡萄糖溶液葡萄糖 40.0g加蒸餾水至100mL，0.055MPa20min1.5%瓊脂培育基瓊脂粉 6.0g蒸餾水 400mL0.103MPa20min底層培育基(無菌操作)趁熱(80℃)，在滅菌瓊脂培育基中(400mL)依次參加：磷酸鹽貯備液 8mL40%葡萄糖溶液 20mL充分混勻，待涼至80℃左右時倒平皿，每皿(φ90mm)25mL，37℃培育過夜以除去水分及檢查有無污染。頂層培育基的成分及制備頂層瓊脂瓊脂粉 3.0g氯化鈉 2.5g加蒸餾水至500mL0.5mmol以L組氨酸－生物素溶液(誘變試驗用)D－生物素(分子量244) 30.5mgL-組氨酸(分子量155) 17.4mg250mL。頂層培育基制備：加熱溶化頂層瓊脂，每100mL10mL10.5mol/L100mL0.103MPa20min2mL45℃水浴中保溫。特別試劑和培育基的配制0.8%氨節(jié)青霉素溶液(鑒定菌株用，無菌配制)40mg0.02mol/L5mL，保存干冰箱。0.1%結晶紫溶液(鑒定菌株用)100mg100mLL0.5mol/LD－生物素溶液(鑒定菌株用)稱取L0.4043gD12.2mg100mL0.103MPa20min4℃冰箱。0.8%四環(huán)素溶液(用于四環(huán)素抗性試驗和氨節(jié)青霉素－四環(huán)素平板)40mg0.02mol/L5mL，4℃冰箱。氨節(jié)青霉素平板(用作TA97TA98TA100菌株的主平板)和氨節(jié)青霉素－四環(huán)素平板(用作TA1021000mL底層培育基910mL磷酸鹽貯備液20mL40%葡萄糖溶液50mL組氨酸水溶液(0.4043g/100mL)10mL0.5mol/L6mL0.8%氨節(jié)青霉素溶液3.15mL0.8%四環(huán)素溶液0.25mL四環(huán)素僅在使用對四環(huán)素有抗性的TA102時參加。以上成分均已分別滅菌或無菌制備。組氨酸－生物素平板(組氨酸需要試驗用)每1000mL中由以下成分組成：底層培育基 914mL磷酸鹽貯備液 20mL40%葡萄糖溶液 50mL組氨酸水溶液(0.4043g/100mL)10mL0.5mol/L生物素 6mL以上成分均已分別滅菌。二甲基亞砜：光譜純，0.103MPa20minS－90.4mol(MgCl23.8g100mL。1.65mol/L(KCl12.3g100mL。0.2mol(PH7.4500mL磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(14.2g/500mL)440mL磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)(13.8g/500mL)60mLPH7.4，0.103MPa20min輔酶－Ⅱ(氧化型)溶液：準確稱取輔酶－Ⅱ，用無菌蒸餾水溶解配制成0.025mol/L溶液，低溫保存(－20℃以下)。葡萄糖－6－磷酸鈉鹽溶液：稱取葡萄糖－6－磷酸鈉鹽，用無菌蒸餾水溶解配制成0.05mol/L，低溫保存(－20℃以下)。10%s－910mL磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH7.4)6.0mL氯化鉀溶液(1.65mol/L) 0.2mL氯化鎂溶液(0.4mol/L) 0.2mL葡萄糖－6－磷酸鹽溶液(0.05mol/L)1.0mL輔酶Ⅱ溶液(0.025mol/L) 1.6mL肝S－9液 1.0mL混勻，置冰浴中待用?；罨到y(tǒng)(S－9和S－9用哺乳動物如大鼠，經(jīng)誘導劑處理，取肝組織制備勻漿，9000g離心，上清液為S－9組分，與關心成分以適當比例組成S－9大鼠肝S－95DWistar150g5～6(Aro－clor1254或國產(chǎn)PCB200mg/mL500mg/kg(體重)無菌操作一次腹腔注射，5d后斷頭處死動物，取出肝臟稱重后，用穎冰冷的0.15mol/L氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次，以便除去能0.1mol/L3mL，連同燒杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝臟，在玻璃勻漿器(低于4000r/min，往復1～2min)，或組織勻漿器(20230r/min，1min)中制成肝勻漿。以上操作需留意無菌和局部冷環(huán)境。將制成的肝勻漿在低溫(0～4℃)9000g10minS－9分裝于無菌冷凍管或安瓿中，每安瓿2mL－80℃低溫保存。S-9(Lowry40mg過量蛋白將會抑制回復突變率，并經(jīng)間接致癌物(誘變劑)鑒定其生物活性合格后貯存于深低溫或冰凍枯燥，保存期不超過一年。S－9S－9(S－9Ames(1983(－20℃以下)貯存。混合液臨用時穎無菌配制，或濾過除菌。一般按1∶910%混合液。用每皿0.5mLS－920～50μLS－90.5mLS－9S－950μL)。S－9菌株及其鑒定和保存承受四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102、。TA97TA98碼型誘變劑；TA100TA102誘變劑，如甲醛、各種過氧化氫化合物和絲裂霉素C等交聯(lián)劑。一般用來測試受試物誘變性時，必需通過四個菌株的檢測。必要時可增加TA1535，TA1537TA104菌株特性應與Ames試驗標準相符(見表A1鑒定菌株的基因型：a.在收到培育菌株后；b.當制備一套的冷凍保存株或冰凍枯燥菌株時；c.當每皿自發(fā)回變數(shù)不在正常范圍時；d.當對標準誘變劑喪失敏感性時；e.使用主平板傳代時；f.投入使用前。鑒定方法如下：5mL37℃振蕩(100/min10h16h組氨酸缺陷型的鑒定100mL底層培育0.5mg分子D－0.6mL100mLL－100mL0.4043g)1mL0.5mg分子D0.6mL50℃左右，各倒兩個平皿。接種在培育基外表，37℃48h。結果：四株菌在有組氨酸培育基平皿外表各長出一條菌膜，無組氨酸培育基平皿上除自發(fā)回變菌落外無菌膜，說明受試菌株確為組氨酸缺陷型。脂多糖屏障缺陷的鑒定加熱溶化養(yǎng)分肉湯瓊脂培育基。0.1mL50℃左右)適量倒入平皿，0.1%結晶紫溶10μL，37℃24h，每個菌做一個平皿。結果：陽性者在紙片四周消滅一個透亮的抑制帶，說明存在rfa(深粗型)突變。這種變化允許某些大分子物質進入細菌體內并抑制其生長。TA97、TA98、TA100TA102氏菌沒有抑制帶。R加熱溶化養(yǎng)分肉湯瓊脂培育基，冷卻至50℃左右，適量倒入平皿中，平放凝固，用移液器吸0.8%氨節(jié)青霉素10μL，在凝固的培育基外表依中線涂成一條帶，待氨節(jié)青霉素溶液干后，用接種環(huán)與氨節(jié)青霉素帶相穿插劃線接種要鑒定的菌株，并且接種一個不具有R因子的菌株作氨節(jié)青霉素抗性的比照(一個平皿可同時鑒定幾個菌株)，37℃24h。結果：424h效應，證明它們都帶有R四環(huán)素抗性的鑒定5～10μL0.80.8%氨節(jié)青霉素溶液，在養(yǎng)分肉湯瓊脂培育基平皿外表依中線涂成一條帶，待四環(huán)素和氨芐青霉素液干后，用接種環(huán)與四環(huán)素和氨節(jié)青霉素帶相穿插劃線接TA102R)，37℃24h。結果：TA102菌株生長不受抑制，比照菌株有一段生長抑制區(qū)，說明TA102菌株有抗四環(huán)素效應。uvrB在養(yǎng)分肉湯瓊脂培育基平皿外表用接種環(huán)劃線接種需要的菌株。接種后的平皿一半用黑紙掩蓋，在距15W33Cm8s，37℃24h。結果：對紫外線敏感的三個菌株(TA97、TA98、TA100)僅在沒有照耀過的一半生長，具有野生型切除修復酶的菌株TA102仍能生長。自發(fā)回變率的測定882mL45℃水浴中保溫。在每管頂層培育基中，分別參加待鑒定的測試菌株的菌液0.1mL，一式二份，輕輕搖勻，快速將此試管的內容物傾入已固化的底層培育基平皿中，轉動平皿，使頂層培育基均勻分布，平放固化，37℃培48h結果：每一株的自發(fā)回變率應落在表A1所列正常范圍內。6.3鑒定合格的菌種應保存在深低溫(如－80℃)9%光譜級DMSO件下(－196℃)，或者冰凍枯燥制成干粉，4℃保存。除液氮條件外，保存期一般不超過2年，主平板貯存在4℃，二個月后丟棄，TA102受試物劑量、溶劑和特別處理0.2μg，5mg，或溶解度允許，或飽和濃度，或對細菌產(chǎn)生最小毒性濃度，每種受試物在允許最高劑量下用44個)以上劑量，每劑量間隔不超過5應做三個平皿，否則應說明選定劑量的理由。溶劑可選用水、二甲基亞砜(每皿不超過0.4mL)，或其他溶劑(毒性劑量以下)。無論選用什么溶劑均應無誘變性。假設遇特別樣品作格外規(guī)處理時應在報告中說明。對以下幾種狀況可作如下處理：含組氨酸樣品：依據(jù)食品中測得的組氨酸含量假設能誘發(fā)回變率的增高可加設組氨酸平行比照組；或將檢品經(jīng)XAD－Ⅱ樹脂柱過濾洗脫預處理。食品包裝材料及其制品成分：依據(jù)材料或制品的組成成分，可分別實行過篩抽提、蒸發(fā)殘渣等技術處理。揮發(fā)性樣品：可承受真空枯燥器處理等方法。自然植物材料：可按植物化學方法制備粗制品或純制品。方法和步驟可分為平板摻入法、預培育平板摻入法及點試法等，分別表達如下：平板摻入法增菌培育：取養(yǎng)分肉湯培育基5mL，參加無菌小三角瓶或無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培育物接種于養(yǎng)分肉湯培育基內，37℃振蕩(100/min10h1～2×109活菌數(shù)，培育瓶可用黑紙包裹，以防光線照耀細菌。底層培育基平皿假設干個。溶化頂層培育基分裝于無菌小試管，每管2mL，在45℃水浴中保溫。在保溫的頂層培育基中依次參加測試菌株穎增菌液0.1mL，混勻；加受試物0.05～0.2mL(需活化時加10%S－9混合液0.5mL)，再混勻，快速傾入底層培育基上，轉動平皿使頂層培育基均勻分布在底層上，平放固化，37℃48h另做一陽性比照和空白比照，不加測試物只加標準誘變劑(見附錄A2.2，A2.3)或溶劑，如二甲基亞砜(光譜純或分析純)，其他方法同上。預培育平板摻入法：預培育對于某些受試物可取得較好效果。因此可依據(jù)狀況確定，是否進展預10%s－9混合液)和37℃20min30℃30min2mL點試法8.1.18.1.28.1.3在水浴中保溫的頂層培育基中依次參加測試菌株增菌液0.1mL10%S－90.5mL)，混勻，快速傾入底層培育基上，轉動平皿，使頂層培育基在底層上均勻分布。平放固化后取無菌濾紙圓片(直徑為6mm)，留神放在已固化的頂層培育基的適當位置上，用移液器取適量受試物(如10μL)，點在紙片上，或將少量固體受試物結晶加到紙片或瓊脂外表，37℃培育48hA2.1，A2.3)或溶劑(如二甲基亞砜)，其他步驟同上。結果的判定和報告摻入法的結果判定：以直接計數(shù)培育基上長出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生長良好條件下，2乘以空白比照數(shù))，并有劑量反響關系或至少某一測試點有可重復的并有統(tǒng)計學意義的陽性反響，即可認為該受試物為誘變陽性。點試法的判定：如在受試物點樣紙片四周長出較多密集的回變菌落與空白比照相比有明顯區(qū)分者，可初步判定該受試物為陽性，但應當用摻入法試驗來確證。結果報告：出報告時，陽性結果至少應做三次測試，陰性結果至少進展二次測試，才能對受試物作出判定。受試物的誘變性要用平板摻入試驗來確證。報告中應注明試驗條件和附上全部結果資料，對結果有疑義者需經(jīng)統(tǒng)計分析，同一樣品必需包括活化和非活化的結果，劑量單位為每平板微克，特別例外。結果記錄和報告格式見附錄A3.1A3.2。附錄A菌株生物學特性鑒定標準、標準診斷性誘變劑、試驗記錄及報告格式(補充件)A1菌株生物學特性鑒定標準、標準診斷性誘變劑、試驗記錄及報告格式菌株生物學特性鑒定標準結果見表A1。表A1〔表略〕A2標準誘變劑的測試結果及表示方法A2.1標準誘變劑在點試中的試驗結果見表A2。A2〔表略〕500；＋＋＋＋——＞500。柔毛霉素和疊氮鈉溶解在水中，其他全部化合物溶解在DMSO中。用PCB