植物組織培養(yǎng)室的構建及培養(yǎng)基植物材料消毒液第一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日植物組織培養(yǎng)實驗室的構建第二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日主要內容：一、植物組織培養(yǎng)實驗室設計二、儀器和設備三、玻璃器皿和用具四、培養(yǎng)條件第三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日一、實驗室設計標準組織培養(yǎng)室包括洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）第四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日１、洗滌室（區(qū)）玻璃器皿和塑料器皿１、洗包括用自來水、洗液、洗滌劑清洗２、干包括自然晾干和烘箱干燥第五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日2、藥品室存放常用的化學試劑無機鹽類、有機物、生長調節(jié)劑等第六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日3、制備室完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設備：藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.培養(yǎng)基的配制生理生化測定第七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日4、儲存室（區(qū)）存放配制后的培養(yǎng)基或未用完的培養(yǎng)基第八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日5、滅菌室即消毒室，是培養(yǎng)基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒滅菌的地方第九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日6、操作室也稱接種室，是開展組織培養(yǎng)研究包括接種、繼代、細胞融合等的場所。主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉移、試管苗的繼代、原生質體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術程序。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關門時的空氣擾動。

第十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日7、培養(yǎng)室培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設備而定。其設計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。第十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)室：第十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，先移到馴化室進行煉苗，帶生根成活后，再移到田間苗圃。第十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日二、儀器和設備1、烘箱陳列于洗滌室作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌測定培養(yǎng)物的干重氣浴第十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日2、冰箱陳列于制備室中作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液激素、酶制劑。第十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日3、滅菌鍋陳列于滅菌室中類型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋作用：培養(yǎng)基、水和各種器皿的消毒第十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日4、超凈工作臺陳列于操作室（接種室）中類型：垂直式和水平式作用：無菌操作第十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日5、pH計陳列于制備室中作用：測定培養(yǎng)基及酶液的pH值第十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日6、顯微鏡陳列于觀察室中類型：倒置顯微鏡原生質體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細胞活力觀察解剖顯微鏡立體觀察第十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日7、天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑第二十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日三、玻璃器皿及用具1、玻璃器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等顯微鏡下觀察用的：細胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等。第二十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日2、微孔過濾器（細胞過濾器）滅菌用：如激素一般用石棉濾膜第二十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日3、細胞計數(shù)器統(tǒng)計培養(yǎng)細胞的用具4、接種用具如鑷子、剪刀、解剖刀、接種針等第二十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日思考題1、一個正規(guī)的組織培養(yǎng)實驗室應具備哪些房間？2、組織培養(yǎng)常用的設備有哪些？各有何用途？3、組織培養(yǎng)的環(huán)境條件有哪些？第二十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日第二十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的選擇

第二十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

培養(yǎng)基的制備是組培的核心工作，外植體之所以能沿著不同的組培途徑生長、分化、成苗都取決于選用不同成分的培養(yǎng)基來調節(jié)控制的。第二十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)基的成分無機營養(yǎng)成分+有機營養(yǎng)成分=基本培養(yǎng)基其它添加物固化劑植物生長調節(jié)劑有機營養(yǎng)成分無機營養(yǎng)成分培養(yǎng)基組成第二十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日1.無機營養(yǎng)成分：第二十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日1)大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素。（C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca）氮：由硝酸鹽和銨鹽提供銨鹽過高會引發(fā)玻璃化苗2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。（Fe，Cu，Zn，B，Mo，Mn等）微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調節(jié)。Fe由螯合物的形式提供:Na2.EDTA無機鹽供應不足時，植物會出現(xiàn)缺素癥狀。

1、無機營養(yǎng)成分第三十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日＊當某些營養(yǎng)元素的供應不足時，愈傷組織所表現(xiàn)出來的癥狀如下：氮：某些組織表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色；不能形成導管；氮，鉀或磷：細胞過度生長，形成層組織減退；硫：非常明顯的褪綠；鐵：細胞分裂停止；硼：細胞分裂停滯，細胞伸長；錳或鉬：影響細胞伸長。第三十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日不同營養(yǎng)條件對植物組織培養(yǎng)的影響-MSSalts

GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

Somerootgrowthbutreduceddevelopmentofshoots（1/10）MSMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.(2MS)第三十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

碳源：最常用的是蔗糖，提供碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應用。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%，即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時可用2.5%，但在胚培養(yǎng)時采用4%-15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。

2、有機營養(yǎng)成分第三十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日維生素：維生素(vitamin)這類化合物在植物細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。雖然大多數(shù)的植物細胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上，還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長。

第三十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用VH(生物素)、VB11(葉酸)、VB12（鈷胺素)等。一般用量為0.1—1.0mg／L。有時用量較高。VB1對愈傷組織的產生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關系。Vc有防止組織變褐的作用。第三十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日氨基酸(AA)：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。

有時應用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-000mg/L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。第三十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日天然復合物：其成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應盡量避免使用。第三十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日?1)椰乳是椰子的液體胚乳。?2)香蕉主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對發(fā)育有促進作用。第三十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日?3)馬鈴薯(potato)

去?4)水解酪蛋白

?5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)第三十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日肌醇(myo—inosltol)又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖轉化而成，還可進一步生成果膠物質，用于構建細胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結合成植酸鈣鎂，植酸可進一步形成磷脂，參與細胞膜的構建。使用濃度一般為100mg/L，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。第四十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmedium不同營養(yǎng)條件對植物組織培養(yǎng)的影響-sucrose

第四十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日3、植物生長調節(jié)物質

在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是植物培養(yǎng)基的關鍵物質，它以很微小的量影響著再生植株的形態(tài)建成?；九囵B(yǎng)基保證培養(yǎng)物的生存和最低的生理活性植物激素定向的誘導外植體的生長分化第四十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日國際植物生理協(xié)會公布的植物激素包括：赤霉素（GA）細胞分裂素(CTK)生長素(AUX)乙烯（Eth）脫落酸（ABA）油菜素內酯（BR）第四十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

作用：頂端分泌，誘導細胞分裂，促進生根。用量：mg/L

（1）生長素(AUX)：第四十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)

用法：溶于95%酒精或者NaOH種類：第四十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日生長素作用強弱順序：IAANAAIBA2,4-D強弱2，4-D常用于誘導愈傷組織，IBA和NAA常用于生根第四十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.Extensivecallusgeneration(1/5)NAAPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.Somecallus(10xNAA)不同營養(yǎng)條件對植物組織培養(yǎng)的影響-AUX

第四十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日種類：6-BA(6-芐基腺嘌呤)Kt(kinetin激動素)Zt(zeatin玉米素)TDZ（Thidiazuron）用法：溶于0.5MHCl和NaOH

（2）細胞分裂素(CTK):

作用：根尖分泌，促進細胞分裂,誘導芽的分化，延緩組織衰落。第四十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant不同營養(yǎng)條件對植物組織培養(yǎng)的影響-CTK

(1/5BAP)第四十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日GA3：作用：促進幼胚發(fā)育，促進細胞伸長，打破休眠。用法：易溶于水，一般用95%的酒精配成母液貯存。

（3）赤霉素(GA)第五十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日（4）乙烯作用：催熟，促進植物落葉、早衰等，影響培養(yǎng)物的生長和分化。（5）脫落酸作用：促進脫落和衰老，在組培中或許促進，或許抑制愈傷的分化作用：作用可能與CTK類似，但是用量遠小于CTK。（6）油菜素內酯第五十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日生長素促進DNA的復制赤霉素促進G1-S,并縮短S期細胞分裂素促進細胞質的分裂第五十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日瓊脂是一種由海藻中提取的多糖類物質，本身并不提供任何營養(yǎng)，40℃凝固。固體培養(yǎng)時最好的固化劑。用量：0.7%-1%。4固化劑-瓊脂第五十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日活性炭(activecarbon)：活性炭為木炭粉碎經加工形成的粉沫結構，它結構疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5—30g/L。它可以吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5—羥甲基糖醛及激素等。5其他成分第五十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日活性炭(activecarbon)：作用：利用其吸附能力，減少一些有毒物質的影響，防止褐變；利于生根。濃度：5—30g/L。5其他成分第五十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內生菌污染。濃度：5—20mg/L。第五十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日6、水作用：是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是雙蒸水,以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質。大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第五十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日1、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:

①保證各物質成分的準確性②配制時的快速移?、郾阌诘蜏乇２亍?.2培養(yǎng)基的配制第五十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日化學藥品及試劑漢語名分子式生產公司分子量純度硝酸銨NH4NO3

上海通亞精細化工廠80.04分析純磷酸二氫鉀KH2PO4

中國江蘇南京中山集團公司化工廠136.09

硝酸鉀KNO3

上海鑫達精細化工有限公司101.10

硫酸鎂MgSO4.7H2O山東省化工研究院246.47

氯化鈣CaCl2.2H2O(上海)四聯(lián)化工廠147.03

硫酸錳MnSO4.4H2O上海試劑工廠169.02

硫酸鋅ZnSO4.7H2O山東濰坊市試劑廠287.54

硼酸H3BO3

濟南化學試劑廠61.83

碘化鉀KI上?；瘜W采購站166.064

鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O北京五十六0一化工廠241.95分析純氯化鈣CaCl2.6H2O濟南試劑總廠237.93

五水硫酸銅CuSO4.5H2O濟南化學試劑廠249.68

第五十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日

漢語名分子式生產公司分子量純度乙二胺四乙酸鈉Na2-EDTA.2H2O濟南試劑總廠372.24分析純硫酸亞鐵FeSO4.7H2O山東博山化學試劑廠278.01分析純

甘氨酸C2H5NO2

中國科學院上海生物化學研究所75.07分析純鹽酸吡哆醇B6C8H11O3N.HCl中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑站205.64

鹽酸硫胺素B1C12H17ClH4OS.HCl中國新興化工試劑研究所337.27

煙酸B3C6H5NO2

北京芳草醫(yī)藥化工研制公司123.11化學純肌醇C6H12O6

中國政翔化學試劑研究所180.16

3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleaceticacid）天津天泰精細化工品有限公司125.1分析純萘乙酸NAAC12H10O2

中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司186.21化學純葉酸C19H19O6N7

上?；瘜W試劑廠441.422,4-D（2,4-dichlorophenoxyaceticacid）上海雪滿生物科技有限公司

6-BA（N6-benzylaminopurine）上海伯奧生物科技有限公司225.25

蔗糖sucrose天津市廣成化學試劑有限公司342.29分析純瓊脂Agar國藥集團化學試劑有限公司B.R第六十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。

母液的配制方法：第六十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日MS培養(yǎng)基配制表母液化合物含量（終濃度）mg/L母液稱量（mg）配制量（ml）吸取量（ml/L）1號NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（擴大20倍）502號CaCl24404400同上503號ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（擴大100倍）104號Na2－EDTAFeSO4.7H2O37.327.8746556100（擴大200倍）55號VB1VB6甘氨酸煙酸0.40.520.5202510025500（擴大100倍）106號肌醇1001000100107蔗糖3％30g8瓊脂0.6％－1.2％6－12g第六十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日MS母液配制：MSI 大量元素20X MSII 微量元素200X MSIII 鐵鹽 200X MSIV 有機物 200X MSV 肌醇 200X

激素 0.1mg/ml第六十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日植物激素母液的配制⑴生長素類：IAA、NAA、2，4-D、IBA配制：先按要求稱好100mg藥品，置于小燒杯中，用0.1NNaOH溶解，再用蒸餾水定容到1000mL，再于試劑瓶保存。則實驗室NAA濃度為0.1mg/ml第六十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日⑵細胞分裂素類：

BA、KT、ZT配制：先用0.5N鹽酸溶解100mg藥品，再用蒸餾水定容至1000mL，然后保存。則實驗室BA濃度為0.1mg/ml第六十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期日3.滅菌：