細胞與酶固定化第一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一一、酶與細胞固定化的概念二、天然酶在應(yīng)用中的一些缺陷三、固定化酶特點四、固定化酶的發(fā)展史第一節(jié)概述第二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一一、酶與細胞固定化的概念

借助各種物理或化學(xué)方法，將酶或細胞固定于水不溶性載體上的過程，稱為酶與細胞固定化。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一二、天然酶在應(yīng)用中的一些缺陷1、酶穩(wěn)定性差，易變性失活2、酶和底物只能反應(yīng)一次，難于回收利用，不僅成本高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。3、反應(yīng)液中混入酶蛋白，使產(chǎn)品的分離純化復(fù)雜化。研究固定化酶，可使酶在應(yīng)用上的這些不足得到改善。第四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1、不溶于水:

反應(yīng)完成后，經(jīng)過濾或離心等簡單分離，就可以回收，以重復(fù)使用，降低酶制劑成本。2、具有一定的機械強度:

可將其裝成酶柱，當(dāng)?shù)孜锶芤壕従徚鹘?jīng)酶柱時，就能發(fā)生酶促反應(yīng)，流出液中，即含有酶促反應(yīng)產(chǎn)物，其產(chǎn)物不易帶雜質(zhì)，收率高，易精制。3、穩(wěn)定性提高:

一根酶柱往往可以連續(xù)使用數(shù)十次，而酶活力并無明顯下降。三、固定化酶特點：第五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一四固定化酶的發(fā)展史固定化酶(ImmobilizedEnzyme）是20世紀60年代發(fā)展起來的—項新技術(shù)。它是通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚讣砜`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱。第六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1953年，德國人Grubhofev和Schleith首先開始了酶固定化研究，并第一次實現(xiàn)了酶的固定化。

1960年，日本的千畑一郎開始了氨基?；腹潭ɑ芯浚_始了將固定酶應(yīng)用在工業(yè)上的第一步。

1969年，千畑一郎成功地將氨基?；阜磻?yīng)用于DL-AA的光學(xué)分析，實現(xiàn)了酶連續(xù)反應(yīng)的工業(yè)化。這是世界上固定化酶用于工業(yè)的開端。

1973年，千畑一郎再次在工業(yè)上成功地固定化大腸桿菌細胞，成功實現(xiàn)了L-天冬氨酸連續(xù)生產(chǎn)。第七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一一、基本概念二、酶和菌體固定化方法酶和菌體固定化方法很多，主要有吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法等。

1.吸附法2.包埋法

3.結(jié)合法

4.交聯(lián)法

5.熱處理法三、固定化酶的性質(zhì)四、固定化酶的評價五、固定化酶的應(yīng)用第二節(jié)酶固定化第八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一一、基本概念1.固定化酶：固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶。（分離提純的酶）2.固定化菌體：固定于載體上的菌體或菌體碎片，稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。（菌體即死細胞或細胞碎片上的酶或酶系）第九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一①物理吸附法

通過載體表面和酶分子表面之間的氫鍵、疏水鍵和π-電子親和力等物理作用力，將酶固定于不溶性載體（固體吸附劑）的方法，稱為物理吸附法，簡稱吸附法。1、吸附法（1）原理第十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一常用吸附劑：a.無機吸附劑：高嶺土、皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微孔玻璃、羥基磷灰石，活性炭等。無機吸附劑的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附劑。b.有機吸附劑：纖維素、膠原、火棉膠等。有機吸附劑的吸附容量一般較高，如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶等，吸附容量為70mg蛋白/cm2膜。第十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一

是指在適宜的pH和離子強度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團和離子交換基間的相互作用而達到酶固定化的方法（離子鍵）。最常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。②離子交換吸附法DEAE—纖維素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶第十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（2）制備方法：a.靜態(tài)法：在沒有攪拌、振搖的情況下，將載體直接加入酶溶液，通過自然吸附、解吸、再吸附等過程、制備固定化酶。該法操作簡便，但效率低，耗時，吸附量小且不均勻。b.電沉積法：

在酶溶液中放置兩個電極，在電極鄰近加入載體，接通電源，酶移向電極并沉積到載體表面，以制備固定化酶。該法可提高吸附時局部濃度，增加吸附量，但要注意酶在電場中的穩(wěn)定性。第十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一c.混和振搖裝載法：是實驗室常用方法，載體與酶液混和后，要在攪拌下或搖床連續(xù)振搖下完成固定化。該法固定化較為均勻，要注意攪拌或振搖速率，既不破壞酶和載體結(jié)構(gòu)，又要達到充分混和目的。d.反應(yīng)器裝載法：

這是工業(yè)上常用方法，它將固定化和其后的應(yīng)用連在一起，即先將載體裝于反應(yīng)器中，再加上酶液，然后通過循環(huán)流振動方式使酶和載體達到充分混和。第十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一①pH：影響載體和酶的電荷變化，從而影響酶吸附。②離子強度：多方面的影響，一般認為鹽阻止吸附。③蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。④溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。⑤吸附速度：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。⑥載體：對于非多孔性載體，則顆粒越小吸附力越強。多孔性載體，要考慮吸附對象的大小和總吸附面積的大小。（3）影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素:第十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（4）吸附法的優(yōu)點、缺點

吸附法的優(yōu)點：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時達到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。

吸附法的缺點：酶和載體的結(jié)合力不強，易脫落，會導(dǎo)致催化活力的喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。

世界第一例獲得工業(yè)應(yīng)用的固定化酶是DEAE-SephadexA-25吸附的氨基?；阜磻?yīng)用于

DL-AA的光學(xué)分析。第十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一(1)基本概念：將酶或含酶菌體包埋于各種多孔載體中，使酶固定化的方法，稱為包埋法。(2)包埋常用載體：瓊脂、聚丙烯酰胺、海藻酸鈉、瓊脂糖、角叉菜膠等。(3)包埋法的類型：主要有膠格包埋、微囊型包埋、脂質(zhì)體包埋。2、包埋法第十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一a.膠格包埋或稱凝膠包埋：①常用凝膠：天然膠：瓊脂、海藻酸鈣膠、角叉菜膠、明膠合成膠：聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂第十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一②制備方法：

以天然膠為載體：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等

先將這些天然物，溶于含水介質(zhì)，然后再與酶液混和，最后分別通過各種方法，使之膠化，制成膠包埋的固定化酶。優(yōu)點：包埋條件溫和、操作簡便、酶活影響小缺點：強度差如：膠原可以添加丁醇；

角叉菜膠（卡拉膠）：卡拉膠(K—Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一種多糖。具體方法：將100g酶在37～50℃溶于水中，又將1.7g卡拉膠在40～60℃溶于34ml生理鹽水中，二者混合后冷全10℃，所成凝膠浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成適當(dāng)大小的顆粒，即為固定化酶。海藻酸可添加氯化鈣，使之以膠的形式沉淀下來。第十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一以合成膠為載體（如聚丙烯酰胺凝膠）：

先將酶和丙烯酰胺單體分散于水介質(zhì)中，然后加入聚合促進劑和N.N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的凝膠中。特點：合成膠強度高，對溫度、pH變化耐受性強，但要控制好包埋條件。第二十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一b.微囊型包埋又稱半透膜包埋法：

將酶包埋于由各種高分子聚合物（直徑幾十微米～幾百微米，厚約25mm的半透膜）制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。半透膜孔徑<酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進出，被稱為“人工細胞”。①常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉膠膜②制備方式：相分離法、界面聚合法、表面活性劑乳化液包埋法。分述如下：第二十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一相分離法：利用高聚物在水相和有機相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而將酶包埋于中。

例：以火棉膠（硝酸纖維素）包埋酶時，先將酶的水溶液在含有硝酸纖維素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纖維素在酶液液滴周圍凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉膠囊。第二十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一界面聚合法：

利用在微滴的界面通過加成或縮合反應(yīng)形成水不溶性多聚體制成微囊包埋酶。

例：以尼龍膜包埋酶時，將酶液及親水性單體（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，將疏水性單體（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等與水混溶的有機溶劑。然后，將這兩種互不相溶的液體混和在一起。加入乳化劑乳化，使酶液分散成小液滴。此時，親水性的已二胺與疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，將酶包埋在小球內(nèi)。再加Tween-20，使乳化破壞，用離心分離即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。第二十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一表面活性劑乳化液膜法：

在酶的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達到包埋的目的。該法不含化學(xué)反應(yīng)，簡便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性。第二十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一C、脂質(zhì)體包埋：

將酶包埋于脂質(zhì)體(Liposome)中的方法。脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體。

脂質(zhì)體包埋的特點：

具有一定的機械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應(yīng)用方面受到重視。第二十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一包埋法的優(yōu)點、缺點:包埋法的優(yōu)點在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但是又較牢固的固定化方法。

包埋法的缺點是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴散，對那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網(wǎng)架會對大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴散阻力導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為改變，使活力降低。第二十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一(1)基本概念：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵，與酶結(jié)合在一起的固定化方法，稱為結(jié)合法。(2)類型：

根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，結(jié)合法分為離子鍵結(jié)合法和共價鍵結(jié)合法。3、結(jié)合法第二十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一離子鍵結(jié)合法：

通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法，稱為離子鍵結(jié)合法。常用載體：不溶于水的離子交換劑。DEAE-纖維素TEAE-纖維素DEAE-葡聚糖凝膠第二十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一

制備方法：在一定pH、溫度、離子強度等條件下，將酶液與載體混和攪拌幾個小時，或?qū)⒚敢壕徛鬟^處理好的離子交換柱，使酶結(jié)合于離子交換劑上而制得。

特點：活力損失小，但由于離子鍵結(jié)合，結(jié)合力弱，酶與載體之間結(jié)合不牢固，在pH，離子強度等條件改變時，酶易脫離。第二十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一纖維素瓊脂糖膠葡聚糖凝膠甲殼質(zhì)氨基酸共聚物甲基丙烯醇共聚物常用載體芳香氨基羥基羥甲基氨基載體上的功能基團酶分子上的非必需側(cè)鏈基團游離氨基胍基酚羥基巰基咪唑基羥基b、共價鍵結(jié)合法（共價偶聯(lián)法）：

通過共價鍵，將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)以制備固定化酶的方法。第三十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一

制備方法：由于載體上的功能基團與酶分子上的側(cè)鏈基團間不具有直接反應(yīng)的能力，因此在偶聯(lián)反應(yīng)前，需先進行載體活化，在載體上引進某種活潑基團，然后此活潑基團再與酶分子上某一基團反應(yīng)形成共價結(jié)合。

載體活化的方法很多，分述如下：第三十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一①重氮法：這是帶芳香氨基載體的主要反應(yīng)，即載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，然后再在溫和的條件下和酶分子上相應(yīng)的基團如酚羥基、咪唑基或氨基直接進行偶聯(lián)。常用的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等（見示意圖）第三十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一反應(yīng)式及原理第三十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一②疊氮法：

此反應(yīng)適用于含羥基、羧甲基等的載體，如CM-纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲基纖維素為例，可先在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，這種產(chǎn)物能在低溫、pH7.5～8.5的情況下和酶的氨基直接偶聯(lián)。但疊氮衍生物也能和羥基、酚羥基或巰基反應(yīng)。第三十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：⑴酯化:CM-纖維素先洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴中通入HCl氣體，進行酯化反應(yīng)；然后洗滌，空氣干燥。⑵肼解:把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中，再加入80%水合肼回流反應(yīng)1小時，過濾，洗滌干燥。⑶疊氮化:

肼解后的CM-纖維素（1g）加入150ml2%HCl在冰浴中混合，攪拌滴加9ml3%NaNO2反應(yīng)20min，過濾用冷蒸餾水洗滌，同時加酶(4)偶聯(lián):經(jīng)疊氮化后的載體加入0.05NpH8.0磷酸緩沖液（內(nèi)含250-500mg酶），5℃攪拌2-3小時，過濾，用0.001NHCl，水洗滌，即為固定化胰蛋白酶（凍干保存）

第三十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第三十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一③溴化氰法：帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等常用的反應(yīng)。在堿性條件下載體羥基和溴化氰（CNBr）反應(yīng)生成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶的氨基進行共價偶聯(lián)反應(yīng)。第三十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一④烷基化法：

含羥基的載體也可在堿性條件下和均三氯三嗪等反應(yīng)，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。第三十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一⑤異硫氰酸法：含芳香氨基的載體也可先用硫光氣處理成異硫氰酸(或異氰酸)鹽的衍生物，這樣得到的產(chǎn)物極易在溫和條件下和酶分子的氨基反應(yīng)。由于在中性pH條件下優(yōu)先和α-氨基反應(yīng)，因此可進行選擇性偶聯(lián)。第三十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一共價結(jié)合法特點：

結(jié)合很牢固，酶不會脫落，可以連續(xù)使用較長時間。但載體活化的操作復(fù)雜，同時由于共價結(jié)合時可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性共價偶聯(lián)反應(yīng)中的保護措施：

化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)一般比較激烈，為了減少酶在偶聯(lián)過程中失效，應(yīng)采取如下保護措施：第四十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一①選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體。

例如：采用重氮法時要注意載體的親水性與疏水性；②嚴格控制反應(yīng)條件，提高反應(yīng)的專一性。

例如：使反應(yīng)局限于α-氨基，保護ε-氨基；③應(yīng)用可逆抑制劑或底物，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團，避免試劑影響酶的活性構(gòu)型和相應(yīng)基團。

例如：在進行腺三磷酶(ATPase)固定化時，可先用對羥汞苯甲酸(PHMB)將酶的活性巰基保護起來，然后通過疊氮反應(yīng)將酶偶聯(lián)于羧甲基纖維素上，在完成固定化以后，再用還原劑使-SH活化，這樣可得到高活性的固定化酶。

第四十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一4、交聯(lián)法（1）基本概念利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法。第四十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（2）常用雙功能和多功能試劑：雙功能試劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2-2’-二磺酸多功能試劑：甲苯-2-異氰-4-異硫氰

其中最常用的是戊二醛第四十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（3）制備方式

利用戊二醛兩個醛基都可與酶蛋白分子的游離氨基反應(yīng)，形成Schiff堿，從而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。在沒有其它載體參與，僅通過酶分子間交聯(lián)形成的固定化酶，顆粒很小，而且機械性能不佳，為克服這一缺點，一般可先將酶吸附于載體上，或者包埋于膠內(nèi)或微囊內(nèi)，然后再交聯(lián)制成固定化酶“網(wǎng)”膜或“網(wǎng)”顆粒。這種方法又稱為雙重固定化法。

第四十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第四十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一5、熱處理法

將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。熱處理法只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。

例如：將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌細胞在60～65℃的溫度下處理15min，葡萄糖異構(gòu)酶全部固定在菌體內(nèi)。熱處理法也可與交聯(lián)法或其他固定化法聯(lián)合使用，進行雙重固定化。第四十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一

酶分子經(jīng)固相化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)。酶分子處在一個與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會影響酶原有的性質(zhì)。如微環(huán)境的化學(xué)組成，與酶相結(jié)合的表面結(jié)構(gòu)，底物進入與底物排出微環(huán)境的速度，微環(huán)境的局部pH等。三、固定化酶的性質(zhì)第四十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一就載體物化性質(zhì)和固定化過程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：分配效應(yīng)、空間障礙效應(yīng)、擴散限制效應(yīng)。分配效應(yīng)：由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。第四十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一空間障礙效應(yīng)：固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制（因為載體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障），使酶分子的活性基團不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性中心對底物的定位作用，所造成的對固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)。第四十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一擴散限制效應(yīng)：酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴散阻力。

①外擴散阻力：底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過程中的一種擴散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴散效應(yīng)。②內(nèi)擴散阻力：指底物分子達到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時的一種擴散阻力，它與催化反應(yīng)同時進行。載體小而彎曲的細孔是產(chǎn)生內(nèi)擴散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴散阻力。

第五十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1、穩(wěn)定性

固相酶的穩(wěn)定性比游離酶高，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。（1）熱穩(wěn)定性：固定化酶熱穩(wěn)定性較之天然酶提高。如氨基酸酰化酶第五十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一(2)對蛋白酶水解作用穩(wěn)定性：固相酶比天然酶有更強的抵抗蛋白酶水解作用的能力。第五十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一(3)對變性試劑作用的穩(wěn)定性：

固相酶對各種蛋白變性劑的穩(wěn)定性，一般都比天然酶強。第五十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一(4)保藏穩(wěn)定性：固相酶比天然酶保存的時間更長。

如：天然胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4℃保存4個月，殘留活力僅為原活力的2%。偶聯(lián)于瓊脂糖后，在同樣條件下，卻可保存82%的活力，因此固相酶有利于運輸、貯存和重復(fù)使用。第五十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形。②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。第五十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一2、最適溫度（1）固相酶的最適溫度一般比天然酶高，個別會有所降低。例如：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高5～10℃；

以共價結(jié)合法固定化的色氨酸酶，其最適溫度比游離酶高5～15℃。第五十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（2）同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。

如：氨基?；赣肈EAE-葡聚糖凝膠經(jīng)離子鍵結(jié)合法固定化后，其最適溫度(72℃)比游離酶的最適溫度(60℃)提高12℃；用DEAE-纖維素固定化，其最適溫度(67℃)比游離酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最適溫度卻比游離酶則有所降低。第五十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一3、最適pH

酶經(jīng)固定化后，其作用的最適pH常會發(fā)生偏移，影響固定化酶最適pH的因素主要有兩個。

(1)載體性質(zhì)對最適pH影響：用帶負電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH高。用帶正電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH低。用不帶電荷載體制備的固定化酶，最適pH一般不改變。第五十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一

影響的原因：

因為固相酶顆粒在水溶液中，是被一層幾乎不流動的液體包圍著，這層不流動液體叫做擴散層，擴散層與其周圍外部溶液之間存在著杜南（Donnan）平衡效應(yīng)，即若是多陰離子載體就會吸引溶液中的陽離（如H+），使其附著于載體表面，導(dǎo)致擴散層的H+濃度比其周圍外部溶液高，于是擴散層pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必須向堿側(cè)偏移，才能抵消微環(huán)境作用，使固相酶達到最大效率，因此使用帶負電荷的載體制備的固相酶，其最適pH比游離酶高。反之，亦然。第五十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（2）產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH影響

若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適pH要高。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為堿性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適PH要低。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為中性時，固定化酶最適pH不變。第六十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一影響的原因：由于微環(huán)境擴散限制影響，嵌在載體中的酶，當(dāng)其催化反應(yīng)產(chǎn)生酸性產(chǎn)物時，產(chǎn)物的擴散活動受到微環(huán)境的約束和限制，使產(chǎn)物不易擴散出去，以致在微環(huán)境中，出現(xiàn)局部pH濃度梯度，越靠近微環(huán)境表面的地方pH越低。這時，外部環(huán)境的pH就要提高一點，才能抵消微環(huán)境的這種作用，使酶達到最適pH。第六十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一第六十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一4、底物特異性

固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經(jīng)固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經(jīng)固定化后專一性會發(fā)生變化。

如：

胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白質(zhì)，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽的作用保持不變，而對酪蛋白的作用僅為游離酶的3％左右.

以羧甲基纖維素為載體經(jīng)疊氮法制備的核糖核酸酶，當(dāng)以核糖核酸為底物時，催化速度僅為游離酶的2%左右，而以環(huán)化鳥苷酸為底物時，催化速度可達游離酶的50～60％。第六十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一影響原因：

固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。酶固定在載體上以后，使大分子底物難于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量較小的底物受空間位阻作用的影響較小或不受影響，故與游離酶的作用沒有顯著不同。第六十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一5、米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km’<Km第六十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一四、固定化酶的評價

評價固定化酶的指標評價指標活力測定方法第六十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1、評價固定化酶的指標①

酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活單位。②酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA）所具有的酶活力單位③固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。④操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標。連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）第六十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分數(shù)。⑦相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力⑤⑥第六十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一2、固定化酶的活力測定方法①

振蕩測定法：稱取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液一邊振蕩或攪拌，一邊進行催化反應(yīng)取出一定量的反應(yīng)液進行酶活力測定。②酶柱測定法：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中讓底物溶液以一定的流速流過酶柱收集流出的反應(yīng)液測定其中產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量第六十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

現(xiàn)已用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶主要有。（1）氨基?；高@是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸；生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。五、固定化酶的應(yīng)用第七十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（2）葡萄糖異構(gòu)酶

這是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。此固定化酶在國內(nèi)外均進行過廣泛的研究和應(yīng)用，1973年就已用于工業(yè)化生產(chǎn)。固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備，除用上述熱處理法外，也可用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法、交聯(lián)法或雙重固定化法等進行固定化。第七十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期一（3）天門冬氨酸酶1973年日本用聚丙烯