第五細(xì)胞融合與單克隆技術(shù)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有101頁\編于星期五\22點（優(yōu)選）第五細(xì)胞融合與單克隆技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有101頁\編于星期五\22點細(xì)胞融合實際上包含多個過程：首先是兩個親本細(xì)胞并列，以后膜組織局部破壞，最終形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜。融合細(xì)胞表現(xiàn)的特征性變化，有膜成分和胞質(zhì)成分的交流以及細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率的連續(xù)性。當(dāng)前第3頁\共有101頁\編于星期五\22點細(xì)胞在融合過程中會發(fā)生下列主要變化：

呈致密狀態(tài)的體細(xì)胞在促融合劑的作用下，細(xì)胞膜的性質(zhì)發(fā)生變化；首先，出現(xiàn)細(xì)胞凝集現(xiàn)象；然后，部分凝集細(xì)胞之間的膜發(fā)生粘連；繼而，融合形成多核細(xì)胞；

在培養(yǎng)過程中多核細(xì)胞又進行核的融合而成為單核的雜種細(xì)胞，而那些不能形成單核的融合細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐漸死亡。當(dāng)前第4頁\共有101頁\編于星期五\22點

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞很少會發(fā)生自發(fā)融合（融合頻率大約在10-4~10-6之間），因此要采用生物、化學(xué)或物理的方法人為地促使細(xì)胞融合。當(dāng)前第5頁\共有101頁\編于星期五\22點當(dāng)前第6頁\共有101頁\編于星期五\22點顯微鏡下細(xì)胞融合過程當(dāng)前第7頁\共有101頁\編于星期五\22點融合過程中兩個細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解當(dāng)前第8頁\共有101頁\編于星期五\22點（二）、細(xì)胞融合研究進展Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。當(dāng)前第9頁\共有101頁\編于星期五\22點Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。當(dāng)前第10頁\共有101頁\編于星期五\22點幾種細(xì)胞融合成功的例子生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽牛——龍面花大麥——花生大麥——大豆小麥——矮牽牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麥——蠶豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972當(dāng)前第11頁\共有101頁\編于星期五\22點植物融合細(xì)胞成長狀態(tài)對比:右瓶為地面融合的細(xì)胞;左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞

當(dāng)前第12頁\共有101頁\編于星期五\22點動物細(xì)胞融合實驗使用的小白鼠當(dāng)前第13頁\共有101頁\編于星期五\22點（三）、動植物細(xì)胞的融合過程當(dāng)前第14頁\共有101頁\編于星期五\22點（四）、細(xì)胞融合的意義理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。當(dāng)前第15頁\共有101頁\編于星期五\22點二、單克隆抗體技術(shù)主要組織相容性復(fù)合體當(dāng)前第16頁\共有101頁\編于星期五\22點（一）、何謂單克隆抗體？Ig分子的基本結(jié)構(gòu)：由四肽鏈組成的，二條相同的分子量較小的輕鏈（L鏈）+二條相同的分子量較大的重鏈（H鏈）組成的。L鏈與H鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成一個四肽鏈分子，稱為Ig分子的單體的基本結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第17頁\共有101頁\編于星期五\22點抗體的主要類型與結(jié)構(gòu)：抗體由四條蛋白質(zhì)長短鏈所組成（兩長兩短）抗體分子上有兩個抗原結(jié)合區(qū)（二者相同）抗體與抗原結(jié)合是專一性的（lock&key）是單一抗體分子，另有IgA（二元體）及IgM（五元體）當(dāng)前第18頁\共有101頁\編于星期五\22點?

IgG由4條多肽組成(兩條輕鏈和兩條重鍵)，通過二硫鍵和非共價鍵相連，其分子結(jié)構(gòu)如“Y”型。一端為抗原結(jié)合端(氨基端)——可變區(qū)(V區(qū))，即氨基酸順序隨免疫的抗原不同而異，有兩個相同的能與抗原結(jié)合的部位。另一端(羧基端)氨基酸順序排列比較恒定——恒定區(qū)(C區(qū))，可與具有Fc受體的細(xì)胞相結(jié)合(如巨噬細(xì)胞、K細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)，分別產(chǎn)生不同的效應(yīng)。當(dāng)前第19頁\共有101頁\編于星期五\22點IgG抗體結(jié)構(gòu)模型

（紅色部分為CDR區(qū)域）當(dāng)前第20頁\共有101頁\編于星期五\22點一個抗原分子上通常含有數(shù)個抗原決定簇每個決定簇至少都可誘生出一種專一性抗體蛋白質(zhì)性抗原決定簇含有六個以上氨基酸抗原決定簇抗原分子上可以誘導(dǎo)出抗體的部位或片段，稱之為

抗原決定簇(antigenicdeterminant)或表位

(epitope)。當(dāng)前第21頁\共有101頁\編于星期五\22點存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，又稱表位（epitope）。抗原決定簇的大小相當(dāng)于相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位，一般由5～8個氨基酸、單糖或核苷酸殘基組成。當(dāng)前第22頁\共有101頁\編于星期五\22點抗體與抗原的特異性結(jié)合當(dāng)前第23頁\共有101頁\編于星期五\22點

克隆定義只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。由同一抗原誘導(dǎo)而產(chǎn)生的針對多個抗原決定簇的抗體稱為多克隆抗體。當(dāng)前第24頁\共有101頁\編于星期五\22點

單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology）。（二）單克隆抗體技術(shù)的原理當(dāng)前第25頁\共有101頁\編于星期五\22點（二）單克隆抗體技術(shù)的原理當(dāng)前第26頁\共有101頁\編于星期五\22點NielsK.Jerne

尼爾斯·杰尼

G.Kohler喬治·J·F·科勒C.Milstein塞薩·米爾斯坦1984年10月15日，三位免疫學(xué)家被授予1984年度的諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎。杰尼是丹麥免疫學(xué)界偉大的理論家,他提出了三大理論:抗體形成的自然選擇學(xué)說、抗體多樣性的發(fā)生學(xué)說、免疫系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)學(xué)說,開創(chuàng)了免疫學(xué)的新紀(jì)元,為現(xiàn)代免疫學(xué)的建立奠定了基礎(chǔ),杰尼也被譽為“現(xiàn)代免疫學(xué)之父”?？评帐堑聡庖邔W(xué)家,米爾斯坦是英國分子生物學(xué)家,兩人的突出貢獻是用雜交瘤技術(shù)生成了單克隆抗體,并闡明了單克隆抗體技術(shù)的原理。當(dāng)前第27頁\共有101頁\編于星期五\22點幾個關(guān)鍵問題當(dāng)前第28頁\共有101頁\編于星期五\22點1.HAT選擇原理（酶缺陷型）HAT系統(tǒng)為次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的縮寫。它是根據(jù)嘌呤和嘧啶生物合成途徑設(shè)計的分離雜種細(xì)胞特殊的培養(yǎng)基。當(dāng)前第29頁\共有101頁\編于星期五\22點細(xì)胞內(nèi)核苷酸的生物合成有兩條途徑：一條是主要途徑，該途徑中葉酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氫葉酸還原酶活性，從而阻斷細(xì)胞中DNA的合成；另外一條是補救途徑，該途徑需要兩種酶參與。一種是HGPRT酶(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)，另一種酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶)

。它們可以分別利用次黃嘌呤催化產(chǎn)生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化產(chǎn)生的脫氧胸苷來合成DNA。H、T為應(yīng)急途徑時提供外源核苷酸“前體”。當(dāng)前第30頁\共有101頁\編于星期五\22點核酸合成的主要合成：由核糖與磷酸合成5-磷酸核糖(R-5-P)，在磷酸核糖焦磷酸酶的催化下，與ATP發(fā)生作用生成1-焦磷酸-5-磷酸核糖(PRPP)，以后PRPP再經(jīng)過一系列反應(yīng)而生成次黃嘌呤核苷酸(IMP)。當(dāng)前第31頁\共有101頁\編于星期五\22點?在氨基喋呤存在時，阻斷了核苷酸的從頭合成IMP的途徑，細(xì)胞只能通過HGPRT使次黃嘌呤酸化形成次黃苷酸，再依次轉(zhuǎn)化為AMP及GMP，即通過“補救途徑”依賴外源來合成核苷酸。因此，一個HGPRT－或TK－的細(xì)胞株不可能在含HAT的培養(yǎng)液中生長。但這樣的細(xì)胞與能提供HGPRT或TK酶的細(xì)胞融合后，雜交細(xì)胞能在含HAT培養(yǎng)液中存活下來。當(dāng)前第32頁\共有101頁\編于星期五\22點1.HAT選擇原理當(dāng)前第33頁\共有101頁\編于星期五\22點?如果融合細(xì)胞的親本之一是一個能在體外長期生存的骨髓瘤細(xì)胞系，而另一個親本細(xì)胞是體外增殖能力有限的正常細(xì)胞。如將長期培養(yǎng)系突變?yōu)镠GPRT或TK酶缺陷型的細(xì)胞系，在和正常細(xì)胞融合后，未經(jīng)融合或自身融合的骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中死亡；未融合或自身融合的正常細(xì)胞在體外生存能力有限最終也死亡。存活下來的只有融合細(xì)胞。當(dāng)前第34頁\共有101頁\編于星期五\22點2.骨髓瘤細(xì)胞的選擇?每一個B細(xì)胞只分泌產(chǎn)生一種抗體，若能把此B細(xì)胞由脾臟中挑出來，單獨培養(yǎng)成細(xì)胞株，則可得單一種類的抗體，只會對一種抗原決定簇反應(yīng)，其專一性極高。大量培養(yǎng)此細(xì)胞株，即可有質(zhì)量一定、純度均一的抗體，此即為單克隆抗體。但B細(xì)胞在體外增殖能力非常弱或不增殖，故無法獲得大量的單克隆抗體。當(dāng)前第35頁\共有101頁\編于星期五\22點?骨髓瘤細(xì)胞易在培養(yǎng)基中生長；利用細(xì)胞融合法將骨髓瘤細(xì)胞永久生長的特性導(dǎo)入可生產(chǎn)有用抗體的B細(xì)胞中，則得到可在培養(yǎng)基中永久生長的B細(xì)胞株，此即雜交瘤細(xì)胞株。得到的雜交瘤細(xì)胞既具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力，又具有腫瘤細(xì)胞在體外無限增殖的特點，可不斷在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生單抗。次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）。當(dāng)前第36頁\共有101頁\編于星期五\22點癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞單克隆抗體可產(chǎn)生有用抗體的淋巴細(xì)胞若與癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。細(xì)胞融合融合瘤兩組染色體混合在一起也可培養(yǎng)生長當(dāng)前第37頁\共有101頁\編于星期五\22點多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。當(dāng)前第38頁\共有101頁\編于星期五\22點（三）.細(xì)胞材料的準(zhǔn)備（1）培養(yǎng)基：制備單抗的培養(yǎng)基常用DMEM（小鼠）和RPMI-1640（人）兩種；使用前添加胎牛血清或小牛血清、抗生素、谷氨酰胺等。（2）血清：胎牛血清（球蛋白少）；優(yōu)質(zhì)血清可支持接種量小于20個細(xì)胞/孔的細(xì)胞生長。（3）抗生素：青鏈霉素+慶大霉素+卡拉霉素預(yù)防細(xì)菌污染；兩性霉素+制霉菌素預(yù)防霉菌污染；小鼠體內(nèi)接種清除支原體。當(dāng)前第39頁\共有101頁\編于星期五\22點（四）免疫動物?1.動物選擇

目的：是希望B細(xì)胞在抗原刺激下分化增殖，使之有利于融合成雜交瘤細(xì)胞，尤其是能分泌特異性抗體的雜交瘤融合細(xì)胞頻率增加。?動物選擇應(yīng)與骨髓瘤細(xì)胞來源相同的同一品系動物，多為BALB/c小鼠。當(dāng)前第40頁\共有101頁\編于星期五\22點?2.抗原與載體

抗原可分為可溶性抗原（蛋白質(zhì)、核酸、多糖、多肽等）和顆粒性抗原（細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等）。一般顆粒性抗原都有較強的抗原性，免疫時可不加佐劑；而可溶性抗原免疫時需加佐劑。初次免疫時一般用完全弗氏佐劑將抗原制成乳劑，而以后加強免疫時一般用不完全弗氏佐劑制成乳劑進行免疫。當(dāng)前第41頁\共有101頁\編于星期五\22點?3.免疫途徑不同抗原可經(jīng)不同途徑進行免疫，主要有腹腔注射、皮下淋巴樣器官注射、靜脈注射、脾內(nèi)免疫等，最常用的途徑是腹腔注射。當(dāng)前第42頁\共有101頁\編于星期五\22點?a.腹腔注射：幾乎適合于所有抗原體，特別適合于顆粒性抗原，經(jīng)腹腔注射免疫時還可使用佐劑。?b.皮下淋巴樣器官注射：多適用于可溶性抗原，多點注射有利于提高免疫效果。?c.靜脈注射：不宜用于大顆粒性抗原，不宜作為初次免疫途徑，也不宜加入佐劑，以免引起血栓或過敏反應(yīng)。?d.脾內(nèi)免疫：適于抗原量特別少的情況下使用，但脾內(nèi)免疫多不產(chǎn)生明顯的血清抗體，對免疫效果的判斷有一定影響。當(dāng)前第43頁\共有101頁\編于星期五\22點（五）親本細(xì)胞的準(zhǔn)備?1.脾細(xì)胞的分離:

一般動物需經(jīng)多次加強免疫后才能獲得大量的分泌抗體的B細(xì)胞。在末次免疫后3～5天左右即可取脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞(大多為B細(xì)胞)用于與骨髓癌細(xì)胞進行細(xì)胞融合。?分離脾細(xì)胞可用脾內(nèi)注射培養(yǎng)基輕輕擠壓使淋巴細(xì)胞逸出的方法，也可用不銹鋼網(wǎng)擠壓法分離淋巴細(xì)胞。當(dāng)前第44頁\共有101頁\編于星期五\22點?2.特異性抗原的富集分離的脾細(xì)胞中含有對抗原具有特異性的B細(xì)胞比例相對較少，可以對抗原特異性的B細(xì)胞進行富集。?將抗原包被在培養(yǎng)板或其他基質(zhì)上，然后與脾細(xì)胞結(jié)合，那些表面具有特異性抗體的B細(xì)胞與抗原結(jié)合使得B細(xì)胞黏附于培養(yǎng)板或基質(zhì)上，輕輕洗滌除去不黏附的細(xì)胞，留下的細(xì)胞為具有特異性抗體的B細(xì)胞，用于細(xì)胞融合。當(dāng)前第45頁\共有101頁\編于星期五\22點

3.

骨髓癌細(xì)胞的準(zhǔn)備：?融合親本的骨髓瘤細(xì)胞，最好是同種的骨髓瘤細(xì)胞或漿細(xì)胞瘤系。這些細(xì)胞具有發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，能產(chǎn)生大量所需抗體，但必須是不能產(chǎn)生自身基因編碼的抗體，否則雜交細(xì)胞會產(chǎn)生兩種以上的抗體，無法得到單克隆抗體。?瘤細(xì)胞系必須是對選擇劑敏感的，融合后可以用藥物(選擇劑)把未融合的瘤細(xì)胞除去。常用來自BALB/c小鼠的653、Sp/20、NS-1等。當(dāng)前第46頁\共有101頁\編于星期五\22點4.細(xì)胞融合：?

一般用PEG誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞間進行融合，操作在10min內(nèi)完成；骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞為1～2：10。?將富集的對抗原具有特異性的B細(xì)胞或?qū)⒖乖苯咏宦?lián)到骨髓瘤細(xì)胞表面，再與脾細(xì)胞共溫育，使具有產(chǎn)生特異抗體的B細(xì)胞與交聯(lián)抗原的骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，然后再進行融合，提高融合的特異性。?融合后的細(xì)胞以1~2106個細(xì)胞/ml的濃度接種到96或24孔板中培養(yǎng)。當(dāng)前第47頁\共有101頁\編于星期五\22點促細(xì)胞融合的方法有：A.病毒融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合:

其中仙臺病毒(HVJ)是最早用于動物細(xì)胞融合的融合劑。B.化學(xué)融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合：

其中以聚乙二醇(PEG)最為常用。C.電融合法：利用直流電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞間融合。當(dāng)前第48頁\共有101頁\編于星期五\22點A.病毒融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合?最早被采用的包括皰疹病毒、麻疹病毒和致瘤病毒等有膜病毒，但使用最廣的是滅活的仙臺病毒；?病毒被膜含有膜蛋白，其表面有許多具神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的刺起，它們降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部凝集在病毒周圍，在高pH和Ca2+的條件下，膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中脂類分子重排，從而打開質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞融合。當(dāng)前第49頁\共有101頁\編于星期五\22點用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖

當(dāng)前第50頁\共有101頁\編于星期五\22點?使用仙臺病毒融合懸浮細(xì)胞時，將兩種親本細(xì)胞的懸液混合在一起離心，后將細(xì)胞沉淀懸于滅活的仙臺病毒懸液中，使其進行融合，再洗去病毒，即可將融合的細(xì)胞加入選擇培養(yǎng)液進行選擇培養(yǎng)；?融合貼壁細(xì)胞時，可將兩親本細(xì)胞混合培養(yǎng)，然后將病毒直接加入到混合培養(yǎng)物中，培養(yǎng)一定時間后加選擇培養(yǎng)液進行選擇；融合效率比懸浮細(xì)胞高。當(dāng)前第51頁\共有101頁\編于星期五\22點B.化學(xué)融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合?主要包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿等，其中以PEG最為常用。?

PEG比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便、而且促進細(xì)胞融合的能力更強。?

PEG(polyethyleneglycol,PEG)是一種線形的多聚化合物，有多種不同的分子量，常用于細(xì)胞融合的PEG分子量在1000~4000，濃度在30~50%間。當(dāng)前第52頁\共有101頁\編于星期五\22點PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機理：

帶有大量負(fù)電荷的PEG與水之間的氫鍵結(jié)合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起細(xì)胞凝集，形成大小程度不同的凝集物。細(xì)胞發(fā)生皺縮并大大扭曲變形，鄰近細(xì)胞之間緊密接觸。當(dāng)前第53頁\共有101頁\編于星期五\22點在相鄰細(xì)胞膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質(zhì)顆粒易位并凝聚。接著可能是相鄰的剝?nèi)サ鞍踪|(zhì)的細(xì)胞膜間的類脂質(zhì)與類脂質(zhì)反應(yīng)。繼之，類脂質(zhì)分子的擾動和重排導(dǎo)致接觸的細(xì)胞膜局部發(fā)生融合，形成很小的細(xì)胞質(zhì)橋，之后細(xì)胞質(zhì)橋逐漸擴大，兩個細(xì)胞最終融合。當(dāng)前第54頁\共有101頁\編于星期五\22點聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程當(dāng)前第55頁\共有101頁\編于星期五\22點使用PEG時，通常通過離心使細(xì)胞緊密接觸，然后在細(xì)胞沉淀中加入一定濃度的PEG，稍作用一段時間后(約30秒)后立即加液稀釋以及時終止其作用。

使用化學(xué)促融劑時，Ca2+是必需的。Ca2+的作用機理，有的認(rèn)為是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成為細(xì)胞間的鈣橋，由此引起融合。也有解釋為Ca2+結(jié)合到帶負(fù)電磷脂的電離基上，使磷脂分子在膜上相互分離，由此引起融合。當(dāng)前第56頁\共有101頁\編于星期五\22點PEG誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞融合當(dāng)前第57頁\共有101頁\編于星期五\22點PEG法植物原生質(zhì)體的融合圖1煙草葉肉細(xì)胞和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體融合（40×）

圖2煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體的異源融合煙草洋蔥當(dāng)前第58頁\共有101頁\編于星期五\22點C.電融合法電處理融合法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的細(xì)胞融合技術(shù)，使融合率大為提高。電融合的原理：

當(dāng)細(xì)胞處于強電場脈沖時，電脈沖誘發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)紊亂，膜上會短暫地形成微膜孔，相鄰兩個細(xì)胞緊密排列部位的微孔就會有物質(zhì)交流，形成細(xì)胞膜橋和細(xì)胞質(zhì)橋，進而引起細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞。當(dāng)前第59頁\共有101頁\編于星期五\22點電融合誘導(dǎo)法原理示意圖當(dāng)前第60頁\共有101頁\編于星期五\22點實際操作：

先把待融合的細(xì)胞或原生質(zhì)體混合，取樣置于100V/cm的高頻交流電場中，在非均勻交流電場中形成串珠狀排列；

完整煙草原生質(zhì)體原生質(zhì)體成串當(dāng)前第61頁\共有101頁\編于星期五\22點

再用1~5KV/cm直流電脈沖，微秒沖擊細(xì)胞或原生質(zhì)體的粘接點，細(xì)胞膜造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細(xì)胞質(zhì)得以交換；最后導(dǎo)致新的球狀細(xì)胞的形成。當(dāng)前第62頁\共有101頁\編于星期五\22點電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果當(dāng)前第63頁\共有101頁\編于星期五\22點細(xì)胞核移植中的細(xì)胞融合融合中融合后融合前當(dāng)前第64頁\共有101頁\編于星期五\22點電融合技術(shù)的擴展：?離心電融合：利用離心使相鄰細(xì)胞緊密接觸以提高融合率。?特異性電融合：利用生物素－抗生物素－抗原－抗體橋聯(lián)，使帶有生物素標(biāo)記的骨髓瘤細(xì)胞與具有特異抗體的B細(xì)胞間特異性配對；或直接將抗原標(biāo)記到骨髓瘤細(xì)胞表面，利用抗原抗體特異性結(jié)合使兩種細(xì)胞特異性配對，然后用高壓電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合。當(dāng)前第65頁\共有101頁\編于星期五\22點?細(xì)胞化學(xué)聚集電融合：采用低濃度PEG、PHA或伴刀豆蛋白A等使細(xì)胞聚集接觸，然后用電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合。?磁－電融合：利用磁場使已表面磁化的細(xì)胞相互聚集接觸，然后在用電脈沖誘導(dǎo)融合。當(dāng)前第66頁\共有101頁\編于星期五\22點電融合的優(yōu)點：適應(yīng)的細(xì)胞類型廣；不需加外源因子，如PEG等；對細(xì)胞毒性相對低；融合率高，可達50%~80%；可用于細(xì)胞數(shù)量很少的融合；可定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合;有利于融合細(xì)胞的挑選。當(dāng)前第67頁\共有101頁\編于星期五\22點電融合的不利之處：融合儀價格昂貴；兩細(xì)胞大小差異較大時，電壓較難選擇；融合膜成分不同時細(xì)胞較難融合當(dāng)前第68頁\共有101頁\編于星期五\22點5.融合細(xì)胞的篩選與克隆?在細(xì)胞融合過程中，不僅兩類不同細(xì)胞間發(fā)生融合，兩類親本細(xì)胞也能發(fā)生相互融合現(xiàn)象。含兩個不同親本細(xì)胞核的細(xì)胞稱異核體

或異核細(xì)胞。由同一親本細(xì)胞融合形成的細(xì)胞稱同核體或同核細(xì)胞。?利用PEG和仙臺病毒進行融合時，細(xì)胞融合有一定的隨機性，除形成雜交細(xì)胞外還會出現(xiàn)各親本細(xì)胞自身融合，需對雜交細(xì)胞及時分離或篩選出來。當(dāng)前第69頁\共有101頁\編于星期五\22點?大部分多核細(xì)胞在一周內(nèi)死亡，只有少數(shù)異核細(xì)胞、尤其雙核異核細(xì)胞會存活。并通過有絲分裂使兩個不同親本細(xì)胞的染色體合并在一個細(xì)胞核中，形成雜交細(xì)胞。?利用酶缺陷型、營養(yǎng)缺陷型、溫度敏感性、形態(tài)和行為等標(biāo)志，建立了多種選擇選擇系統(tǒng)，最常用的是酶缺陷型HAT選擇培養(yǎng)法。當(dāng)前第70頁\共有101頁\編于星期五\22點?A.初步篩選：融合后馬上以HAT培養(yǎng)，能活下來的大多為B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞。未融合的骨髓瘤及骨髓瘤細(xì)胞間相互融合的細(xì)胞在HAT中因DNA合成抑制而死亡。未融合的B細(xì)胞及B細(xì)胞相互融合的細(xì)胞在體外培養(yǎng)因無法增殖會漸漸死去。當(dāng)前第71頁\共有101頁\編于星期五\22點?核酸的正常代謝途徑若被氨基蝶呤(A)阻礙，可由補救途徑利用次黃嘌呤(H)通過次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)催化產(chǎn)生肌苷酸(IMP)，并利用胸腺嘧啶核苷(T)通過胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化產(chǎn)生脫氧核苷酸來合成DNA。但骨髓瘤細(xì)胞缺乏TK及HGPRT兩種酶，因此在A存在下無法生長；正常細(xì)胞(如B細(xì)胞)則可經(jīng)由補救途徑繼續(xù)生長。當(dāng)前第72頁\共有101頁\編于星期五\22點?骨髓瘤細(xì)胞與正常的B細(xì)胞形成的雜交瘤，因正常細(xì)胞可以提供TK及HGPRT兩酶，故在HAT培養(yǎng)基中可以正常生長。當(dāng)前第73頁\共有101頁\編于星期五\22點當(dāng)前第74頁\共有101頁\編于星期五\22點?B.抗體專一性篩選：并非所有B細(xì)胞都產(chǎn)生實驗所要的抗體，小鼠原先就存在許多B細(xì)胞株對抗一般疾??；因此要對雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體專一性進行篩選，這也是單克隆抗體制備中最關(guān)鍵的步驟之一。用于篩選雜交瘤細(xì)胞的方法大致有第二抗體法、抗原結(jié)合法和功能篩選法三類；常用的方法是第二抗體法，包括固相放射免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和熒光活化細(xì)胞分類器法(FACS)等，通過這些方法挑出產(chǎn)生專一性抗體的集落。當(dāng)前第75頁\共有101頁\編于星期五\22點?C.細(xì)胞克隆化：通過抗體專一性挑出來的細(xì)胞株，也許仍含有兩群以上的細(xì)胞，因此要進行單克隆化；一般采用有限稀釋法或軟瓊脂法對雜交瘤細(xì)胞進行細(xì)胞克隆化，獲得來自單個細(xì)胞的克??；并對單個細(xì)胞生長出的群落，再次以ELISA篩選專一性抗體，獲得可產(chǎn)生特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。當(dāng)前第76頁\共有101頁\編于星期五\22點?得到穩(wěn)定的抗體后，通常要再以ELISA方法檢定該抗體的亞型是屬于IgG,IgM或IgA等。免疫時間太短的，較可能取得IgM，但一般仍以IgG較多。當(dāng)前第77頁\共有101頁\編于星期五\22點6.單克隆抗體的大量制備：

單克隆抗體的大量制備可分為體內(nèi)法和體外法。體內(nèi)法：可把篩選出來的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生大量腹水，然后以針頭收集所產(chǎn)生的腹水，通常每次可取得3～5mL左右；腹水中的抗體濃度高，可達到1～25g/mL。其缺點是不適合大規(guī)模生產(chǎn)，腹水中有可能混有小鼠本身的抗體，給純化抗體帶來困難。體外法：把融合細(xì)胞在大型培養(yǎng)瓶中用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清即得抗體。缺點是抗體濃度低，僅為0.5～1gmL。當(dāng)前第78頁\共有101頁\編于星期五\22點三、人源性單克隆抗體

和基因工程抗體當(dāng)前第79頁\共有101頁\編于星期五\22點1.EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)：利用類似于皰疹病毒的EB病毒在體外直接感染人外周血淋巴細(xì)胞（來源于淋巴結(jié)、扁桃體、臍帶血、外周血等），使之轉(zhuǎn)化獲得永生能力得到人B淋巴細(xì)胞系，這些細(xì)胞可在體外分泌人抗體。(一)、人源性單克隆抗體當(dāng)前第80頁\共有101頁\編于星期五\22點技術(shù)同鼠－鼠雜交瘤，親本骨髓瘤細(xì)胞主要有來自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，來自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；親本B細(xì)胞來源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但人－鼠雜交瘤的單克隆抗體分泌性能不穩(wěn)定，多數(shù)情況下由于人染色體的丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞失去分泌抗體的能力。

2.人－鼠雜交瘤單克隆抗體：技術(shù)同鼠－鼠雜交瘤，親本骨髓瘤細(xì)胞主要有來自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，來自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；親本B細(xì)胞來源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但人－鼠雜交瘤的單克隆抗體分泌性能不穩(wěn)定，多數(shù)情況下由于人染色體的丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞失去分泌抗體的能力。當(dāng)前第81頁\共有101頁\編于星期五\22點3.人－人雜交瘤單克隆抗體：人－人雜交瘤操作步驟基本上與小鼠－小鼠雜交瘤技術(shù)相同，使用人的骨髓瘤細(xì)胞與人的B淋巴細(xì)胞融合；但可供利用的人骨髓瘤細(xì)胞種類非常有限，人的骨髓瘤細(xì)胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤細(xì)胞；而且人不能像小鼠那樣進行高度免疫，B淋巴細(xì)胞常限于取自外周血(小鼠取自動物脾臟)，激活狀態(tài)不適合做融合；故人－人雜交瘤細(xì)胞在融合、融合后的篩選以及融合細(xì)胞分泌抗體方面仍不理想。當(dāng)前第82頁\共有101頁\編于星期五\22點4.構(gòu)建轉(zhuǎn)入Ig基因組小鼠?將改造過的人的抗體基因組導(dǎo)入小鼠胚胎，得到在免疫后能產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。改造過的抗體除了構(gòu)成抗原識別與抗原結(jié)合部位的三個互補決定區(qū)(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。?用人Ig基因組取代小鼠Ig基因組獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，以后僅需免疫小鼠制作單克隆抗體，但獲得的是人抗體而非小鼠抗體。該技術(shù)難度較大，但已有成功的報道。當(dāng)前第83頁\共有101頁\編于星期五\22點5.嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體：SCID小鼠具有嚴(yán)重免疫缺陷，對外源組織無免疫排斥反應(yīng)，故這種小鼠可接受人體組織或器官移植，形成人－鼠嵌合體小鼠。將人免疫干細(xì)胞移植到SCID小鼠體內(nèi)，SCID小鼠獲得了人的免疫系統(tǒng)。這種小鼠可用任何抗原免疫，從激活的淋巴細(xì)胞中富集抗原特異性人源性B淋巴細(xì)胞，進一步進行細(xì)胞融合或制備抗體庫。當(dāng)前第84頁\共有101頁\編于星期五\22點(二)、基因工程抗體

基因工程抗體是利用基因工程的手段獲得人源性抗體，主要包括以下幾個方面：人－鼠嵌合抗體、改型抗體、抗體片段、噬菌體抗體文庫技術(shù)、表位印跡選擇技術(shù)等。當(dāng)前第85頁\共有101頁\編于星期五\22點抗體的重輕鏈構(gòu)成的可變區(qū)(V區(qū))與識別抗原有關(guān)，具有特異性；而恒定區(qū)(C區(qū))與效應(yīng)功能有關(guān)。人－鼠嵌合抗體就是通過人工改造使抗體的V區(qū)是鼠源的，而C區(qū)是人源的。如此改造的嵌合抗體保留了原來鼠源單克隆抗體的特異性和親和力，人抗小鼠抗體反應(yīng)(HAMA)也明顯減弱。1.人－鼠嵌合抗體：當(dāng)前第86頁\共有101頁\編于星期五\22點人－鼠嵌合抗體的制備

當(dāng)前第87頁\共有101頁\編于星期五\22點2.改型抗體：

也稱CDR移植。用鼠源的CDR(可變區(qū)中和抗原互補結(jié)合構(gòu)成抗原結(jié)合部位的部分）取代人抗體中相應(yīng)的CDR部位，使得抗體中除構(gòu)成抗原結(jié)合部位的3個CDR是鼠源以外，其余均為人源。這種抗體在人體內(nèi)免疫性大大降低。當(dāng)前第88頁\共有101頁\編于星期五\22點改型抗體（CDR移植）當(dāng)前第89頁\共有101頁\編于星期五\22點

Fab抗體：抗體Y形的兩個臂稱為Fab，它由可變區(qū)和小部分的恒定區(qū)組成，利用基因工程的方法構(gòu)建具有可變區(qū)和小部分恒定區(qū)的Fab抗體，這樣的抗體仍具有特異結(jié)合抗原的特性。

單鏈抗體(ScFv)：用短肽接頭[常用(Gly4Ser)3]將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)相連，使其分子變小，更有利于穿透組織和清除，而且易構(gòu)建表達；但親和力會出現(xiàn)一定的下降。3.抗體片段：當(dāng)前第90頁\共有101頁\編于星期五\22點4.噬菌體抗體文庫技術(shù)體外建立一個相應(yīng)于體內(nèi)B細(xì)胞庫的抗體庫，從中篩選所需要的抗體。利用PCR擴增重鏈和輕鏈的cDNA，并插入到噬菌體外殼蛋白的編碼基因中，然后感染E.coli，使抗體基因的表達產(chǎn)物和外殼蛋白一起融合展示在噬菌體表面，成為噬菌體抗體。通過固相化的抗原進行篩選，不能結(jié)合抗原的噬菌體被洗去，結(jié)合的噬菌體被洗脫下來再次感染細(xì)菌進行擴增，多次吸附－洗脫－擴增后可獲得所要的抗原特異性的噬菌體抗體。這些抗體可以做到全部為人源的。當(dāng)前第91頁\共有101頁\編于星期五\22點當(dāng)前第92頁\共有101頁\編于星期五\22點5.表位印模選擇技術(shù)：用特定的已知抗原從抗體組合文庫中或噬菌體抗體文庫中篩選所需抗體，通過抗體可變區(qū)與抗原結(jié)合及編碼輕、重鏈可變區(qū)鼠源性與人源性基因置換、匹配，從而獲得能與抗原特異性反應(yīng)的人源性抗體；將篩選到的含人輕、重鏈基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到骨髓瘤SP2/0細(xì)胞中，該細(xì)胞即可產(chǎn)生人單克隆抗體。當(dāng)前第93頁\共有101頁\編于星期五\22點四、單克隆抗體的應(yīng)用

1.理論研究：?構(gòu)建B淋巴細(xì)胞雜交瘤可用于分析B細(xì)胞的多樣性及其產(chǎn)生機理，并能分析免疫應(yīng)答中抗體的多樣性。?利用單克隆抗體可進行表位