形態(tài)定量技術與生物醫(yī)學研究生學位課程《現代組織化學原理與應用》主講人 李慧主要內容概況圖像分析系統(tǒng)的組成圖像處理和分析的基本方法圖像分析系統(tǒng)的定量測定方法圖像細胞光度技術激光共聚焦顯微鏡激光捕獲顯微切割儀形態(tài)定量技術的應用前景概況形態(tài)定量體視學、圖像分析技術形態(tài)定量技術與生物醫(yī)學概況體視學(stereology) 1961年命名體視學是關于能在結構的切面上測得的2維信息推斷其3維參數的數字方法(E.R.Weibel)從圖像中提取有用的測量數據或信息，非圖像的數值或符號的描述或表達圖像特征的提取；圖像中幾何形態(tài)參數的測量；從二維形態(tài)參數推導出三維形態(tài)參數概況60年代 顯微分光光度技術-組織化學90年代- 圖像分析系統(tǒng)(imageanalysissystem) 圖像細胞儀(imagecytometer) 流式細胞儀(FlowCytometry) 激光共聚焦顯微鏡(Confocal)概況中國體視學會生物醫(yī)學專業(yè)委員會(1988年成立)中國體視學及圖像分析學術年會中國生物醫(yī)學體視學學術年會國際體視學大會(1963年第一屆)國際診斷定量病理學會概況現代組織化學定量技術組化/免疫組化結果分析 定性/半定量分析(有局限性)定量分析圖像分析技術 組織化學和免疫組織化學反應產物的定量分析(光密度測定) 細胞/某一特定成分形態(tài)的定量分析圖像分析系統(tǒng)的組成圖像分析儀涉及計算機、光學、電子學、形態(tài)學、數學、電視技術等多學科概況圖像的處理和分析醫(yī)學圖像處理 大、中、小型真彩色、偽彩色型全自動、半自動型多功能和精密度醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)圖像處理和分析的基本方法 對圖像進行數字處理提高信噪比和清晰度改善和突出圖像質量提取有用或隱含信息客觀的和定量的特性判別、特征描述和數值測量(不依人眼觀察效果為標準)

圖像處理和分析的基本方法圖象處理方法

圖像的預處理、圖像變換、圖像平滑、圖像增強、圖像分割偽彩色圖像和圖像識別等

圖像處理和分析的基本方法濃度信息--灰度(greylevel)代表圖像各部分顏色的深淺灰度等級反映圖像分析儀的分辨率目前圖像分析儀多用256級灰度 (人眼分辨率：20級灰度以下)圖像處理和分析的基本方法圖像預處理 尤其是對模糊、失真或有噪聲的圖像進 行預處理，使之能恢復原來狀況圖像增強 修正灰度；過濾噪聲等改善圖像質量圖像編輯 對圖像進行增補、修改等，去除 不必要 信息，增添某些重要信息，如畫線功 能；剪輯框等圖像分割 將所要研究對象或區(qū)域分離出來(自背景) 樣品(切片)和染色質量影響很大 閾值分割；邊緣分割；數字形態(tài)運算等圖像分析系統(tǒng)的定量測定及方法

應用范圍十分廣泛生物醫(yī)學圖象 X-ray圖像超聲醫(yī)學圖像核醫(yī)學圖像醫(yī)學斷層圖像顯微醫(yī)學或細胞圖像圖像分析系統(tǒng)的定量測定及方法

二維幾何參數測量和灰度參數測量二維幾何參數測量 對細胞及其結構的形狀、大小、輪廓規(guī)則程度等定量測定200種以上的形態(tài)特征參數 較常用者： 細胞(核)面積、周長、直徑、長徑和短徑；平均直徑(不規(guī)則細胞的等效面積的圓直徑)；形狀因子(形狀不規(guī)則的程度)圖像分析系統(tǒng)的定量測定及方法

灰度參數測量

反映圖像的濃度信息灰度測量(Gray)和光密度測量(OD)不完全等同圖像細胞光度技術

圖像細胞光度技術(ImageCytometry，ICM)

指采用某些技術使玻片上的組織細胞成像，測量組織細胞圖像的光度信息，并以吸收光度或熒光光度值的大小表述細胞化學物質含量的多少，以評定組織細胞內化學物質的含量，又稱作細胞圖像光度測量術或成像細胞測量術圖像分析系統(tǒng)的定量測定及方法

應用過程器官、組織和細胞樣本的采集與制備組織細胞的成像、分析和測量數據結果的分析和應用圖像細胞光度技術

測定細胞或其結構經染色后的光密度光密度定量遠較形態(tài)結構定量為復雜，精度要求很高圖像細胞光度技術

定量顯微術 形態(tài)測量(Morphometry)顯微分光光度術(Microspectrophotometry)流式細胞儀(FlowCytometry,FCM)細胞光度術(Cytometry)主要用于定量DNA分析、定量免疫組織化學測定圖像細胞光度技術

DNA

ContentAnalysis

細胞核中DNA含量的定量分析Diploid/Aneuploid(腫瘤鑒別診斷)微觀，較早期的診斷DNA染色-Feulgen染色正常細胞diploid測量值DNAIndex(正常DI=1，惡性腫瘤DI1)G0/G1期、S期和G2/M期細胞周期分析圖像細胞光度技術

免疫組化結果陽性細胞數量、陽性面積百分比、陽性細胞陰性細胞比值陽性細胞的積分光密度值ISH結果定量 非同位素法(酶或熒光標記物)

圖像細胞光度技術

顯微測量光密度技術圖像分析系統(tǒng)性能的生物學評估光學組件缺陷評估

同一細胞在圖像顯示窗不同位置分別測量得出的積分吸光度誤差CV應小于3%，以評價系統(tǒng)是否有效地消除了閃光誤差和照射光強度分布不均對測量結果的影響圖像細胞光度技術

顯微測量光密度技術圖像分析系統(tǒng)性能的生物學評估系統(tǒng)穩(wěn)定性評估

同一顯微圖像分析系統(tǒng)中，不同操作者在不同時間對同一圖像顯示窗位置的同一細胞圖像測量得出的積分吸光度誤差CV應小于1%圖像細胞光度技術

顯微測量光密度技術圖像分析系統(tǒng)性能的生物學評估涂片細胞樣品評估

Feulgen染色，雞紅細胞核涂片其面積的CV應小于10%，單個雞紅細胞核的積分吸光度值CV應小于6%，2個、3個和4個雞紅細胞核的積分吸光度值與單個雞紅細胞核積分吸光度值相比是否呈2、3、4的線性增加，以評定涂片細胞化學物質計量結果的可靠性DNA圖像分析儀與流式細胞儀的比較激光共聚焦顯微鏡

激光共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscopy,LSCM)

一種特殊形式的光鏡，主要是通過激光束掃描樣本形成圖像，然后以數字信號的形式存儲在計算機中并可對其進行進一步分析各種染色、非染色和熒光標記的組織和細胞組織切片，細胞活體的生長發(fā)育特征測定細胞內物質運輸和能量轉換；活體細胞中離子和PH值變化神經遞質研究多重熒光的斷層掃描及重疊；熒光光譜分析熒光組織與細胞的三維動態(tài)結構構件熒光共振能量的轉移的分析；熒光原位雜交研究（FISH）細胞骨架研究基因定位研究；蛋白質間研究原位實時PCR產物分析熒光漂白恢復研究（FRAP）胞間通訊研究膜電位與膜流動性等研究圖像分析和三維重建等分析FRAPFRAP激光共聚焦顯微鏡

“視覺斷層”

可以掃描標本的極窄的片層并成像，即具有較窄的視野深度(深度識別能力：200-400m)只有在焦距平面的信息可以被檢測，在樣本內獲得一個單一的圖像“光學切片”和“顯微CT”

通過調節(jié)不同的焦距(微型步進馬達，0.1m)逐層獲得高反差、高分辨率、高靈敏度的一系列二維光學橫斷面圖像)，最終可以在三維空間中觀察結果和對樣品的結構進行測定LSCMhistory1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術的某些基本原理，獲得了美國的專利。?1967年，Egger和Petran成功地應用共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫斷面。?1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關系和激光掃描器的拉曼光譜學。?1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺商品化的共聚焦顯微鏡，型號為SOM-100，掃描方式為臺階式掃描。?1986年MRC-500型改進為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)。?1987年White和Amos在英國《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時代的到來”一文，標志著LSCM已成為進行科學研究的重要工具。?隨后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相繼開發(fā)出不同型號的共聚焦顯微鏡，產品的性能不斷改進和更新，應用的范圍也越來越廣泛。LSCM成像原理采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。Confocal的基本工作原理Cellculture,3Dshadowprojection(calculatedby"Imaris",BitplaneAG,Zürich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)多熒光電子顯微鏡

透射電子顯微鏡

以電子束透過樣品經過聚焦與放大后所產生的物像，投射到熒光屏上或照相底片上進行觀察。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。掃描電子顯微鏡

掃描電鏡是用極細的電子束在樣品表面掃描，將產生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細胞、組織）表面的立體構像，可攝制成照片。DefinitionofLMD顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細胞從組織三維構造中分離出來，獲得純的細胞群（purecellpopulation），以備進一步作分子水平的研究。顯微切割技術的貢獻就是克服了組織的細胞成分非常繁雜這一重大的缺點。Lasercapturemicrodissection

TheHistoryofLMD1965，BaxterTJ，腎小管1990‘s，紫外激光切割超薄膜上的組織1996，NIH，紅外激光光源，轉運膜技術美國Arcturus公司：熱塑膜德國PALM公司：激光脈沖所產生的壓力AdvanceofLMD⑴無破壞性，用于粘附目的細胞的熱塑膜厚度約為100～200μm,能夠吸收激光產生的絕大部分能量，⑵高精確性，激光定位的準確程度可以達到1μm，切割直徑可以小到2μm，捕獲點范圍達到3～5μm，⑶高效率，每次激發(fā)耗時不超過1秒,,單張轉運膜可以一次捕獲上萬個細胞；⑷自動化程度高，全電腦操作⑸無污染，使用全封閉操作，能避免外來物質的污染。WeaknessofLMD用儀器和耗材昂貴；QIAGEN染色時對后續(xù)反應可能有影響；對涂片的要求比較苛刻等。UseOfLMDCancer腫瘤基因突變檢測腫瘤特異基因表達分析雜和性丟失檢測微衛(wèi)星序列不穩(wěn)定性分析新基因發(fā)現核酸及蛋白質的定量研究染色體畸變分析細胞局部病變病因學PathologyandForensic

組織切片冰凍切片檢驗。法醫(yī)學中的各種細胞涂片,目前常見的法醫(yī)物證檢材如液體類(精液、血液、唾液、精陰混和液)、斑跡類(精斑,血斑,唾液斑,混和斑等)等NotetheuseofLCM

DNA分析基因組DNA時,細胞越大,則需要切割更多的細胞,才能保證包含細胞的全部基因組保持基因組的相對完整性,避免在樣品處理過程中造成DNA的降解和斷裂RNA建議樣本使用冰凍組織塊,同時用Trizol法抽提原始組織樣本RNA,鑒定樣本降解情況,確保樣本質量。常規(guī)HE染色,伊紅和蘇木精配好后用DEPCProtein可以根據需要制備總蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白通過去除白蛋白來減少