病毒感染與細胞凋亡

微生物教研組鄭方亮1醫(yī)學ppt2醫(yī)學ppt細胞凋亡的含義多細胞生物的一種生理性細胞死亡的過程；凋亡過程中，細胞的形態(tài)變化是特有的；凋亡過程中需要基因表達和蛋白質(zhì)合成，特別是酶的合成。概念：是由一系列基因控制并受復雜信號調(diào)節(jié)的細胞自然死亡的現(xiàn)象。3醫(yī)學ppt細胞凋亡和細胞程序性死亡從嚴格的詞學意義上來說，細胞程序性死亡與細胞凋亡是有很大區(qū)別的。細胞程序性死亡的概念是個功能性概念，描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。細胞凋亡則是一個形態(tài)學的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學特征的與壞死完全不同的細胞死亡形式。一般認為凋亡和程序性死亡兩個概念可以交互使用，具有同等意義。

4醫(yī)學ppt凋亡形態(tài)特征Apoptosis“葉子凋落”5醫(yī)學ppt6醫(yī)學ppt7醫(yī)學ppt左，正常胸腺細胞；右，凋亡胸腺細胞8醫(yī)學ppt凋亡形態(tài)特征9醫(yī)學ppt壞死細胞凋亡受累范圍多為連續(xù)的大片細胞多為單個細胞細胞膜完整性受到破壞仍保持完整性細胞體積增大、細胞腫脹減小、固縮→固縮性壞死核染色質(zhì)散在的小集聚，呈絮狀積聚在核膜下，呈半月狀細胞器腫脹，尤以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯崩解仍保持完整，未崩解溶酶體破壞，酶外溢保持完整，酶不外溢后期細胞破裂、溶解、殘屑被巨噬細胞吞噬細胞胞漿裂解成許多碎片（凋亡小體），被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬炎癥反應引起周圍組織炎癥反應不引起周圍組織炎癥反應10醫(yī)學ppt分子生物學機制細胞程序性死亡是細胞之間信號傳導的結(jié)果之一。環(huán)境和發(fā)育的刺激通過配體和受體之間的相互作用傳遞到胞內(nèi)，即配體攜帶的信號通過與穿膜細胞受體胞外區(qū)域的結(jié)合反應到受體的胞內(nèi)區(qū)域，完成信號由胞外到胞質(zhì)的傳遞，然后開始胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的復雜作用，最后導致凋亡的發(fā)生。11醫(yī)學ppt凋亡的過程信號傳遞階段死亡信號的探測胞外信號（配體與受體的特異結(jié)合）胞內(nèi)信號（毒素、射線引起的損傷或病毒感染）下游死亡機制的傳遞效應階段

Caspase的激活最終造成細胞死亡。12醫(yī)學ppt13醫(yī)學ppt凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)特點①多樣性：不同種類的細胞系統(tǒng)不同②偶聯(lián)性：與增殖分化的信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④多途性：同一誘導因素啟動多條信號轉(zhuǎn)導途徑14醫(yī)學ppt凋亡的激活途徑Fas介導的細胞凋亡線粒體參與的細胞凋亡15醫(yī)學pptFas介導的細胞凋亡富含半胱氨酸死亡結(jié)構(gòu)域deatheffectordomain16醫(yī)學ppt線粒體參與的細胞凋亡

BID17醫(yī)學ppt

Caspase

可激活名叫CAD（caspase-activatedDnase）的核酸酶，CAD能在核小體的連接區(qū)將其切斷，形成約為200bp整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下CAD存在于胞質(zhì)中，并且與抑制因子ICAD/DFF-45蛋白結(jié)合，不能進入細胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，釋放出CAD，使它進入細胞核降解DNA。Caspase可直接破壞細胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質(zhì)的固縮。

Caspase可作用于幾種與細胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細胞結(jié)構(gòu)。除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。效應階段18醫(yī)學ppt19醫(yī)學ppt吞噬20醫(yī)學ppt凋亡相關(guān)的基因和蛋白細胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。21醫(yī)學pptCaspase家族Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是引起細胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號途徑激活，能將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點：①活性中心富含半胱氨酸；②對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，所以命名為caspase（cysteine-containingaspartate-spicificprotease），方便起見本文稱之為凋亡酶；③都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個活性亞基。22醫(yī)學ppt分為兩類：一類為執(zhí)行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，它們可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一類為啟動者（initiator），如caspase-8、9，收到信號后，能通過自剪接而激活，然后引起caspase級聯(lián)反應，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、723醫(yī)學pptApaf-1Apaf-1被稱為凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細胞過多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1含有3個不同的結(jié)構(gòu)域：①CARD（caspaserecruitmentdomain）結(jié)構(gòu)域，能召集caspase-9；②ced-4同源結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合ATP/dATP；③C端結(jié)構(gòu)域，含有色氨酸/天冬氨酸重復序列，當細胞色素c結(jié)合到這一區(qū)域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而這一過程又需要細胞色素c和caspase-9參與。Apaf-1/細胞色素c復合體與ATP/dATP結(jié)合后，Apaf-1就可以通過其CARD結(jié)構(gòu)域召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應。24醫(yī)學pptBcl-2家族Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它們在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細胞色素c等凋亡因子的釋放。Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4），并且通常有一個羧端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembraneregion,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，BH3是與促進凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一類是促進凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu)，如Bid、Bad。雖然Bcl-2蛋白存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，但主要定位于線粒體外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。25醫(yī)學ppt26醫(yī)學pptFasFas又稱作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細胞，激活的T和B淋巴細胞，巨噬細胞，肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細胞等。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后，會激活caspase，導致靶細胞走向凋亡。27醫(yī)學pptp53一種抑癌基因，其生物學功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖，直到DNA修復完成。如果DNA不能被修復，則誘導其調(diào)亡，研究發(fā)現(xiàn)喪失p53功能的小鼠胸腺細胞對糖皮質(zhì)激素誘導的調(diào)亡反應和正常細胞相同，而對輻射誘導的調(diào)亡不敏感。28醫(yī)學pptC-myc

在許多人類惡性腫瘤細胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過度表達，它能促進細胞增殖、抑制分化。在凋亡細胞中c-myc也是高表達，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面它能激活那些控制細胞增殖的基因，另一方面也激活促進細胞凋亡的基因，給細胞兩種選擇：增殖或凋亡。當生長因子存在，Bcl-2基因表達時，促進細胞增殖，反之細胞凋亡。29醫(yī)學pptATM

ATM（ataxiatelangiectasia-mutatedgene）是與DNA損傷檢驗有關(guān)的一個重要基因。正常細胞經(jīng)放射處理后，DNA損傷會激活修復機制，如DNA不能修復則誘導細胞凋亡。ATM是DNA損傷檢驗點的一個重要的蛋白激酶30醫(yī)學ppt細胞凋亡的檢測方法◆形態(tài)學觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標記法◆彗星電泳法（cometassay）◆流式細胞分析

31醫(yī)學pptDNA電泳鑒定–+壞死凋亡32醫(yī)學ppt細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖1．細胞色素c誘導0h2．細胞色素c誘導1h3．細胞色素c誘導2h4．細胞色素c誘導3h5．細胞色素c誘導4h6．陰性對照7．Marker（自趙允、翟中和）33醫(yī)學ppt細胞凋亡的意義確保正常發(fā)育生長：清除多余的細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細胞積極防御功能：對病毒感染細胞阻止復制34醫(yī)學ppt凋亡的重要性