利用實時定量PCR和2－△△CT法分析基因相對表達量METHODS25,402–408(2001)AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsingReal-TimeQuantitativePCRandthe2－△△CTMethodKennethJ.Livak*andThomasD.Schmittgen?,1*AppliedBiosystems,FosterCity,California94404;and?DepartmentofPharmaceuticalSciences,CollegeofPharmacy,WashingtonStateUniversity,Pullman,Washington99164-6534摘要：現(xiàn)在最常用的兩種分析實時定量PCR實驗數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異。2－△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2－△△CT衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關(guān)鍵詞：反轉(zhuǎn)錄PCR定量PCR相對定量實時PCRTaqman反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是基因表達定量非常有用的一種方法（1-3）。實時PCR技術(shù)和RT-PCR的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)（4

,5）。實時定量PCR的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異。絕對定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實時PCR進行絕對定量已有多篇報道（6-9），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（10,11）。在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理後表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。用實時PCR對基因表達進行相對定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對這些假設(shè)的驗證。2－△△CT方法可用于定量PCR實驗來計算基因表達的相對變化：2－△△CT公式的推導(dǎo)，以及實驗設(shè)計，有效性評估在AppliedBiosystemsUserBulletinNo.2（P/N4303859）中有介紹。用2－△△CT方法分析基因表達數(shù)據(jù)在文獻中也有報道（5,6）。本文介紹了該方法的推導(dǎo)、假設(shè)以及應(yīng)用。另外，本文還介紹了2－△△CT兩種衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。1.2－△△CT方法1.1.2－△△CT方法的推導(dǎo)PCR指數(shù)擴增的公式是：這里，Xn是第n個循環(huán)後目標(biāo)分子數(shù)，X0是初始目標(biāo)分子數(shù)，Ex是目標(biāo)分子擴增效率，n是循環(huán)數(shù)，CT代表目標(biāo)擴增產(chǎn)物達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。任因此年：球X將T劍是輔目標(biāo)始分子勸達到裙設(shè)定發(fā)的閾捏值時遣的分旬子數(shù)每。C懼敢T,吼X圾是戲目標(biāo)籍分子希擴增超達到欣閾值飛時的臺循環(huán)姨數(shù)。車K掩x熊是一娃個常換數(shù)。獄對于厲內(nèi)參對反應(yīng)遞而言吸，也嚇有同久樣的薪公式走：擴用X最T尋除以杠R刮T數(shù)得到恢：魔對于巨使用觸T提aq絮ma運n體探針講的實法時擴守增而結(jié)言，輸X預(yù)T蹦和肚R胸T究的值少由一堪系列高因素漆決定月：包弊括探畫針?biāo)謳У膬鰺晒鈨攬髮?dǎo)還基團掀、探奪針序顯列對方探針填熒光秀特性喇的影仿響、枕探針晃的水月解效抬率和帳純度鑼以及患熒光咸閾值逗的設(shè)迎定。莖因此磨常數(shù)騾K勿并不志一定是等于旗1敞。心假設(shè)作目標(biāo)懸序列購與內(nèi)生參序籍列擴錦增效慢率相碰同：或：減X泰N皂代表約經(jīng)過內(nèi)均一矮化處檢理過本的初風(fēng)始目遙標(biāo)分揮子量粘；△始C脈T辨表示香目標(biāo)獵基因灶和內(nèi)種標(biāo)基懶因C莫T賠值的解差異累（C驅(qū)T,之X絞－C借T,騾R賓）整舉理上困式得搭：五最后頌用任驚一樣彩本q睡的明X甜N服除踩以參沃照因那子（死ca闖li樹br濕at料or站,足cb淹）的煩X紋N頭得到俱：煙在這蛛里毯對于旋一個昌少于攜15毅0b售p版的擴厭增片魔斷而獄言，帥如果鞭M燃g慨2+狗隙濃度拆、引重物都率進行椅了適搬當(dāng)?shù)募膬?yōu)化佛，擴冷增效頓率接楚近于杰1噸。因霜此目席標(biāo)序妄列的蜂量通稻過內(nèi)丙均一撥化處指理之汁后相雕對于理參照裳因子暖而言敵就是互1.像2.股2航－△佳△C業(yè)T弄方法帥的假幸設(shè)和執(zhí)應(yīng)用貨要使主△△鏡CT直計算墨方法斥有效草，目搭標(biāo)序趴列和園內(nèi)參泛序列家的擴柄增效毫率必翠須相類等。蜘看兩粗個反意應(yīng)是倚否具愚有相塌同的癥擴增誼效率蛛的方潮法是仙看他卸們模六板濃利度梯浪度稀米釋後閉擴增仙產(chǎn)物逮△C慈T如染何變漁化。波圖1攏顯虧示的捆是鋼cD污NA闊樣甩品在恐1僚00拾倍孤稀釋繡范圍販內(nèi)的詳實驗滾結(jié)果瞇。對還于每蠶一個棵稀釋悄樣本攀，都鴿用G貸AP壤DH浩和拿c-均my慕c貿(mào)特異對的熒搏光探萬針及成引物管進行揚擴增俘。計決算出著c-路my召c友和筑GA遺PD狠H榜的平拋均C臂T攝值以釀及△滾C嫁T捉值，惕通過讀cD述NA擋濃泉度梯密度的芹lo刊g值譜對△地C兔T腳值作踢圖，雨如果慈所得國直線刪斜率循絕對賄值接團近于邪0，洽說明抵目標(biāo)范基因會和內(nèi)蠢標(biāo)基懼因的罩?jǐn)U增萌效率價相同長，就灘可以褲通過鵝△△轉(zhuǎn)CT岡方法間進行凈相對拍定量廈。在簽圖1已中，煩直線腎斜率曲是0顏.0獨47祥，因務(wù)而假域設(shè)成門立，囑△△鑄CT惕方法采可以冬用來盛分析健數(shù)據(jù)窩。如禽果兩宮個擴奴增反旦應(yīng)效夏率不界同，洲則需營要通鴉過定個量標(biāo)嚼準(zhǔn)曲牛線和汽絕對蔥定量波的方塑法來帝進行戀相對元定量題；或億者也舒可以牢重新鐮設(shè)計喜引物寇，優(yōu)亮化反垮應(yīng)條渾件使畝得目易標(biāo)序切列和拖內(nèi)參掏序列饑具有防相同植的擴恒增效忘率。弓1.弊3.素2凱－△留△C大T脅內(nèi)標(biāo)悲和參償照因漁子的迷選擇其使用仙內(nèi)標(biāo)做基因溝的目桶的是虛為了精對加瘦入到治反轉(zhuǎn)進錄反炭應(yīng)中親的R汗NA碧進巾行均患一化業(yè)處理神。標(biāo)銅準(zhǔn)的禁看家謠基因恒一般鄙都可未被用麻作內(nèi)晴標(biāo)基他因。幸適合慶于實泰時騰PC用R莊反應(yīng)杯內(nèi)標(biāo)辯基因滅包括輪GA給PD模H，輔β任-a方ct厘in完，β來2麗-m祥ic瘋ro順gl鄭ob蠅ul呈in燈以榮及r恩RN納A似。當(dāng)撲然，緞其它秧的看炒家基句因也蹈同樣跨能被侮用作盒內(nèi)標(biāo)蛋。我填們推駕薦在很應(yīng)用出某一干基因硬作為慈內(nèi)標(biāo)責(zé)之前挖首先隙確證氣該基西因的框表達淚不會竿受實屆驗處向理的城影響兔。驗奧證實旗驗處興理是注否對莫內(nèi)標(biāo)樹基因駱表達睜產(chǎn)生黨影響趴的方俘法在縱2.其2佳部分奧有描平述。志2深－△多△C搭T盟方法繞中參房照因口子的典選擇犬決定柱于基憲因表握達定齊量實燃驗的辛類型剝。最裂簡單鼻的設(shè)升計就朱是把妻未經(jīng)賺處理儀的樣搜品作喬為參咱照因靠子（洲ca擠li斗br勝at狠or炸）尖。經(jīng)熟內(nèi)標(biāo)柏基因蕉均一績化處坐理後資，通揭過方絹法計宿算，疫目標(biāo)諸基因觸表達尾差異疾通過溉經(jīng)過哥處理村的樣剛本相替對于負(fù)未經(jīng)釣處理鏟的樣皺本的笛倍數(shù)漿來表痛示。引對于聯(lián)未經(jīng)水處理葵的參磨照樣壽，△被△C螞T倡=0幼，而體2夫0旦=1黑。所坡以根銀據(jù)定脊義，盒未處鋼理樣雅本的綱倍數(shù)飛變化驢為1響。渡而對鈔于那悠些經(jīng)異過處射理的校樣本挽，相戒對于森參考妻因子指基因匆表達兔的倍魚數(shù)為里2肉－△堆△C犧T浸。同嶼樣的本分析扔也可疾用于咳不同和時相辮的基靈因表違達差鍛異，誠在這多種情俊況下鄙，一限般選肌0志時刻典的樣非本作代為參系照因坐子。慈有些凱情況紙下，鈔并不棗是比辰較不殊同處刮理樣北本基異因表油達差膠異。攀例如擁，有換的是箭想看朵某一流器官申中特喘定竟mR語NA后的三表達間。在艇這種祝情況跡下，繩參照框因子厚可能會是另撫一器星官中咸該萌mR盾NA倡的賴表達怪。表酷1顯跡示了欣大腦雪和腎臉臟總劃RN隊A童中c刃-m拐yc敏和喚GA掩PD異H悼轉(zhuǎn)錄典本的斗CT筋值讓。在壽這一酒個例狠子中鼠，大南腦被塑人為夸的選插擇為火參照豈因子顧，通閑過計微算得何到腎維臟c嚷-m鈔yc慎表抗達量筋經(jīng)G魚AP區(qū)DH陰校車正後燭相對牛于大呼腦的際表達糕量的炸結(jié)果秤。盡灶管相惑對定脈量方圾法可冰用于榴這種萬組織棄之間顆的比穿較，爛但結(jié)生果的不生物氏學(xué)解額釋是禍相當(dāng)僻復(fù)雜戴的。冰不同療種類劈細(xì)胞喪中目暈標(biāo)和筍參照若轉(zhuǎn)錄善本單姓一的解相對章量變傍化可驗?zāi)茉谖踩魏呜懱囟☉c的組旁織中帳都存畜在。搖1.否4.棄2俘－△壘△C匠T畢方法蝕的數(shù)藏?fù)?jù)分島析掛實時列定量莊PC妥R所心得到僚CT涼值可籠以很躁容易去的輸侮出到否表格油程序剖如M筐ic泥ro調(diào)so傻ft眉E遭xc彈el妻中去沫。為擠了顯鏈?zhǔn)緮?shù)你據(jù)分賄析過旦程，黑我們悉在這犯里給升出了列一個沸基因械表達越定量尿的實坦驗數(shù)污據(jù)和麻樣本氣列表隊。通隱過β顛-a挽ct似in脂均鄙一化謀處理泄，我賞們對婚目標(biāo)聽基因插fo升s-在gl譽o-界my哥c助的表宵達變堵化進斯行了逮監(jiān)測片。在軋8h炎的見時間餅范圍蠶內(nèi)，傅在每研一時益間點喂都取職3喇個重思復(fù)樣紗本，賺每一飽樣本敘在c坐DN嬸A蓮合成咽之後夾都做發(fā)定量宣PC揮R違，數(shù)茄據(jù)分臺析用棒到了渣公式洽9，臉即：舉Ti滿me寸x勾表瞞示任愈意時遞間點譯，T妄im吉e張0表澤示經(jīng)匪β過-a呼ct制in余校娘正后暈1去倍量賓的目撫標(biāo)基皺因表頌達。叔0隆時刻太目標(biāo)杏基因駝和內(nèi)書標(biāo)基撥因的容平均膝C田T躲（見榴圖2棚第雄8貴欄）眾被用汪于公誰式9澡中抄。通罪過公謹(jǐn)式9笨計流算出坦每一惰個樣陽本目汁標(biāo)基侮因表犁達通容過β唱-購ac弄ti撈n據(jù)均一群化處授理後旱相對申于0好時胞刻的憶倍數(shù)置（見廈圖2滔第初9伸欄）顧。平剝均S屋D，律CV帝由叼每一糕個時酷間點掙所取膏的三歌個重娛復(fù)樣劣求得煉。用創(chuàng)這種鄉(xiāng)分析箱方法預(yù)，在牌0甲時刻欠的平可均倍富數(shù)變游化接旬近于待1。尿我們蒙發(fā)現(xiàn)臘通過價檢測哥在麗0怨時刻畫平均逢倍數(shù)誼變化康是否艦為1肢可問以很溝方便傾的驗婚證三淘個重姿復(fù)樣怕品之桃間是俘否有刮錯誤蛾或者仆誤差佩。如死果得短到的鴨結(jié)果芽與1事偏差灶很大權(quán)，則縫表明坐存在含計算渾錯誤紀(jì)或者繼是很掛高的丘實驗脫誤差友。金在前玉面的河例子洋中，貌在每做一時葡間點飼上分省別取帶了三她個獨副立的符R排NA降樣汽本進愈行了惹分析責(zé)。因匠此對守每一隊個樣安本分犁別處忌理，未通過科計算蒜後取覆結(jié)果誦的平奶均值午就非夠常重捧要。計如果麥?zhǔn)峭б粯有鼙具M使行攻PC鬼R迅擴增狂的重朱復(fù)，銅這就肺需要蛾首先電求出值平均雀CT旱，然貫後再燭進行發(fā)計錯算。玻怎么肚樣計委算平螞均值遲就要瘦看目序標(biāo)基速因和清內(nèi)參啊基因摘是在只同一較個管斑子中斤擴增辮還是協(xié)在不擾同的艘管子吩中擴古增。倆表要1叫給出植了目圖標(biāo)基姐因（軌c-莫m宋yc符）橫和內(nèi)筐參基飯因（懲GA嗚PD醉H龍）在橋不同決管中寇擴增皂的實提驗數(shù)稱據(jù)。景在這殺里不里應(yīng)該狹把任逮一單冶個的濁c剛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