等電聚焦電泳演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)一、IEFE定義

IEFE一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點(diǎn)電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。當(dāng)前第2頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)各種蛋白質(zhì)各自都有一個(gè)等電點(diǎn),在一特殊的pH環(huán)境中,蛋白質(zhì)分子呈電中性,在電場(chǎng)中不會(huì)遷移。

等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說(shuō)被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。

當(dāng)前第3頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)二、IEFE的特點(diǎn)

（一）優(yōu)點(diǎn)1.分辨率高（精密度可達(dá)0.01pH單位），靈敏度高（最低檢出量達(dá)0.1ng）。2.電泳區(qū)帶相當(dāng)狹窄。3.重復(fù)性好。當(dāng)前第4頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)（二）缺點(diǎn)1.要求用無(wú)鹽溶液，而在無(wú)鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀。2.樣品中的成分必須停留在其pI，不適用在pI不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。當(dāng)前第5頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)分辨率較不連續(xù)PAGE更高，特別適合于分離分子量相同而電荷不同的生物大分子。

當(dāng)前第6頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)三、IEFE的基本原理當(dāng)前第7頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)蛋白質(zhì)分子在不同pH下的解離狀態(tài)

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI當(dāng)前第8頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)

在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通入直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，正極附近是低pH區(qū)，負(fù)極附近是高pH區(qū)。當(dāng)前第9頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)蛋白質(zhì)分子的電聚焦過(guò)程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白質(zhì)分子在負(fù)極端蛋白質(zhì)分子在正極端蛋白質(zhì)樣品中各組分聚焦成區(qū)帶

—+當(dāng)前第10頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)

在這個(gè)從正極到負(fù)極pH逐漸增加的直流電場(chǎng)中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入這個(gè)環(huán)境，不同的蛋白質(zhì)帶上不同性質(zhì)和數(shù)量的電荷，向著一定方向移動(dòng)，遷移到與其相同的等電點(diǎn)位置上停留下來(lái)，即被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，得以分離。

當(dāng)前第11頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)進(jìn)行IEFE必須具備3個(gè)條件：

①有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的pH梯度②有一個(gè)抗對(duì)流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不再重新混合③電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)鑒定分離的區(qū)帶當(dāng)前第12頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)（一）pH梯度的建立用多種兩性電解質(zhì)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度當(dāng)前第13頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)1.理想的載體兩性電解質(zhì)（Carrierampholytes）應(yīng)具備的特征：

①分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；④在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻；⑤兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；⑥可溶性好；⑦對(duì)280nm的紫外光沒(méi)有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測(cè)定。當(dāng)前第14頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)2.載體兩性電解質(zhì)的合成

本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的pI值。pH范圍：pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺Ampholine（LKB）加成反應(yīng)當(dāng)前第15頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第16頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第17頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)3.pH梯度的形成

載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物,在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度。

當(dāng)前第18頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)pH梯度形成的過(guò)程當(dāng)前第19頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)

㈠沒(méi)通電時(shí)的變化所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電，只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團(tuán)數(shù)目相等，凈電荷為零。當(dāng)前第20頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)㈡引入電場(chǎng)時(shí)的變化載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽(yáng)極遷移，帶有最低等電點(diǎn)的分子（荷最多的負(fù)電）將最快地向陽(yáng)極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時(shí)才停止。其次一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（荷其次多的負(fù)電）也將向陽(yáng)極移動(dòng)，直到它的凈電荷被減少到零才停止。當(dāng)前第21頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)㈢電泳結(jié)束后的變化

所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加pI級(jí)數(shù)的辦法將分別在陽(yáng)、陰極之間到達(dá)它們自己的位置而給出一個(gè)pI梯度。當(dāng)前第23頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第24頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第25頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)電解槽中，通電后，正負(fù)兩極都會(huì)發(fā)生電極反應(yīng)：正極端反應(yīng)：6H2O→O2+4H3O++4e-負(fù)極端反應(yīng)：4H2O+4e-→2H2+4OH-在負(fù)極引起pH值的升高，在正極pH下降，另外在電極槽的正極端放的是酸性溶液，負(fù)極端放的是堿性溶液造成了在電極附近pH的急劇變化。（圖a）

當(dāng)前第26頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)pH+-a當(dāng)前第27頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)由于載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物所組成的，設(shè)其中某一成分為A，它的pI=pH’，當(dāng)環(huán)境中的pH>pH’時(shí)，它帶負(fù)電荷，朝正極移動(dòng)。(圖b)當(dāng)前第28頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)pH+-bpH=pH’A-當(dāng)前第29頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)環(huán)境pI<pH’時(shí)，它帶正電荷，朝負(fù)極移動(dòng)，直至移動(dòng)到它的等點(diǎn)電處，在那里聚集。由于兩性電解質(zhì)A在它的pI處具有一定的緩沖能力，因此在它附近形成一個(gè)pH穩(wěn)定區(qū)域。（圖c）當(dāng)前第30頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)pH+-cpH=pH’A+當(dāng)前第31頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)同樣載體兩性電解質(zhì)中各種兩性電解質(zhì)也會(huì)各自遷移到它們的等電點(diǎn)處，由于它們的數(shù)量足夠多，各自的等電點(diǎn)相差很小，從而形成一個(gè)pH梯度。（圖d）當(dāng)前第32頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)pH+-d當(dāng)前第33頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)假設(shè)在一個(gè)系統(tǒng)中含有極多的有適當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)和它的等電點(diǎn)處有一定的緩沖能力的兩性電解質(zhì)，因此形成的pH梯度將是連續(xù)平滑的。

當(dāng)前第34頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)pH梯度的選擇在測(cè)定未知蛋白時(shí)，可先采用pH3-10的載體，經(jīng)初步測(cè)定后改用較窄的以提高分辨率。當(dāng)前第35頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第36頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)（二）支持介質(zhì)的選擇

作用：防止擴(kuò)散抗對(duì)流1.液體介質(zhì)：蔗糖、Ficoll2.凝膠介質(zhì)：瓊脂糖，葡聚糖、PAG當(dāng)前第38頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)（三）聚焦后的檢測(cè)方法

當(dāng)前第39頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)1.各種染色法

考馬斯亮藍(lán)染色銀染色同工酶染色專一蛋白染色熒光標(biāo)記以及免疫方法當(dāng)前第40頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)2.掃描與定量

激光光源強(qiáng)度大、單色性好，所以對(duì)IEFE譜帶的掃描最合適。注意：操作程序和條件必須嚴(yán)格相同當(dāng)前第41頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)3.其它檢測(cè)方法電泳轉(zhuǎn)移雙相電泳滴定曲線分析當(dāng)前第42頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)蛋白質(zhì)樣品及分離容量

1、電聚焦有高的分辨力，一般樣品不需提

純，分析上可用來(lái)測(cè)定混合物中某一成

分的相對(duì)比例。

2、大量提純蛋白質(zhì)，則應(yīng)預(yù)先初步提純。

有些物質(zhì)（如核酸）聚焦時(shí)會(huì)沉淀，應(yīng)

預(yù)先除去。

3、蛋白質(zhì)應(yīng)不含鹽，因鹽濃度高電流大，

易發(fā)熱，而且鹽離子遷移至兩極產(chǎn)生酸

堿，占據(jù)了分離的有效部位。

當(dāng)前第43頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)等電點(diǎn)聚焦的分離容量受下列幾個(gè)因素影響：1、聚焦后每一區(qū)帶的蛋白量取決于密度梯

度所能支持的蛋白質(zhì)，提高密度可以提

高分離容量；

2、容量與區(qū)帶高度的平方成正比，降低電

壓可使區(qū)帶變寬，提高容量，但分辨率

降低，聚焦時(shí)間長(zhǎng)，用窄的pH梯度范圍

可以使區(qū)帶變寬，提高分辨率。

3、分離的容量與柱的橫載面成正比，用440

毫克柱時(shí)，可加粗蛋白質(zhì)5克，每一區(qū)帶

可達(dá)一克。當(dāng)前第44頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)四、等點(diǎn)聚焦電泳的應(yīng)用

1.分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽①區(qū)分人血清蛋白②測(cè)出異常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆區(qū)帶的檢測(cè)2.測(cè)定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽3.雙相電泳中，IEFE作為第一相當(dāng)前第45頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第46頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)參考書(shū)目《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》科學(xué)出版社

郭堯君《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》

科學(xué)出版社

汪家政

范敏

主編《電泳》

科學(xué)出版社

何忠效張樹(shù)政

主編當(dāng)前第47頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)實(shí)驗(yàn)血紅蛋白的等點(diǎn)聚焦電泳

當(dāng)前第48頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)[原理]

Hb具有四條多肽鏈和球蛋白

（α、β、γ、δ）

pI

HbAα2β2>95%6.87

HbA2α2δ22-3%7.38

HbFα2γ2<2%6.98

HbA3<6.87

當(dāng)前第49頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)HbA正常成人血中主要的Hb成分。HbA2

正常成人Hb中的一個(gè)次要成分，當(dāng)

胎兒出生時(shí)，其濃度不到1%，以后

稍增多，在正常成人中其平均值自

2.2%至2.6%左右，最高范圍一般

不超過(guò)3.5%。

當(dāng)前第50頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期六\18點(diǎn)HbF1866年發(fā)現(xiàn)，是胎兒和初生兒的Hb的主要成分，足月的初生嬰兒血中大約有70-80%為HbF，其余為HbA。嬰兒出生后不久，HbF的濃度迅速減少，同時(shí)HbA相應(yīng)增多，絕大多數(shù)