胚胎工程胚胎工程:是指對(duì)動(dòng)物早期胚胎或配子進(jìn)行的多種顯微操作和處理技術(shù)，如體外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)。胚胎工程的建立：1890年，英國劍橋大學(xué)的生物學(xué)家將純種安哥拉兔的兩個(gè)四細(xì)胞胚胎移入一個(gè)純種比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，成功的產(chǎn)下兩個(gè)純種安哥拉兔，這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次證明同種動(dòng)物的胚胎在異體動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育的可能性。20世紀(jì)30~70年代，相繼獲得了綿羊、山羊、豬和馬等胚胎移植的后代。胚胎移植技術(shù)的成功和應(yīng)用帶動(dòng)和加速了體外受精技術(shù)的研充,1951年,美籍華人生殖生物學(xué)家張明覺和澳大利亞生物學(xué)家奧斯汀在研究家兔體外受精時(shí),發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物精子與卵子受精前的或能現(xiàn)象，進(jìn)一步揭示了精子獲能能的機(jī)理，并改進(jìn)了卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件。20世紀(jì)60~80年代，試管小鼠、試管大鼠、試管牛、試管羊以及試管嬰兒等相繼問世。20世紀(jì)80年代以來胚胎分割、性別鑒定、體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因胚胎、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。體內(nèi)受精和早期胚胎發(fā)育各種家畜精子的發(fā)生大體可以分為三個(gè)階段：第一階段：位于曲精管壁的精原細(xì)胞先分裂為兩個(gè)細(xì)胞，然后繼續(xù)進(jìn)行數(shù)次有絲分裂，產(chǎn)生多個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞。第二階段：初級(jí)精母細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行兩次分裂，第一次分裂產(chǎn)生兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，每個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞在分裂一次產(chǎn)生兩個(gè)含單倍染色體的精子細(xì)胞。第三階段：圓形的精子細(xì)胞經(jīng)過變形其中的細(xì)胞核變?yōu)榫宇^的主要部分，高爾基體發(fā)育為頭部的頂體，中心體演變?yōu)榫拥奈?，線粒體聚集在尾的基部形成線粒體鞘。細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)濃縮為球狀（原生質(zhì)滴），隨精子的成熟過程向后移動(dòng)，直到最后脫落。卵子的發(fā)生：動(dòng)物的胚胎在性別分化以后（胎兒期）卵原細(xì)胞有絲分裂形成大量的初級(jí)卵母細(xì)胞（初級(jí)卵母細(xì)胞被卵泡細(xì)胞包圍形成卵泡），初級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過兩次分裂形成一個(gè)卵細(xì)胞，三個(gè)極體，（減數(shù)第一次分裂是在雌性動(dòng)物排卵前后完成，其產(chǎn)生一個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞和一個(gè)極體,進(jìn)入輸卵管，準(zhǔn)備與精子受精，減數(shù)第二次分裂是在精子與卵子結(jié)合的過程中完成的）。當(dāng)卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個(gè)極體時(shí)說明卵子己經(jīng)完成受精，這是判斷卵子是否受精的標(biāo)志。哺乳動(dòng)物卵泡的形成和在卵巢內(nèi)的儲(chǔ)備是在出生前（胎兒期）完成的這是精子和卵子發(fā)生上的重要區(qū)別.受精作用的過程：準(zhǔn)備階段1-精子的獲能:在多種動(dòng)物中，剛剛排出的精子,不能立即與卵子受精，必須在雌性生殖道發(fā)生相應(yīng)的生理變化后才能獲得受精的能力.準(zhǔn)備階段2.卵子的準(zhǔn)備：卵子一般在排出后2~3小時(shí)才能被精子穿入，卵子在排出后都要在輸卵管內(nèi)進(jìn)一步成熟，當(dāng)達(dá)到減數(shù)第二次分裂中期時(shí)，才具備與精子受精的能力。受精階：哺乳動(dòng)物受精過程主要包括精子穿越放射冠和透明帶，進(jìn)入卵黃膜原核形成和配子結(jié)合。獲能后的精子和卵子相遇后，首先發(fā)生頂體反應(yīng)，使頂體內(nèi)的酶釋放出來。放射冠是包圍在透明帶外面的卵丘細(xì)胞群，精子所釋放的頂體酶可以直接溶解卵丘細(xì)胞之間的物質(zhì)，形成精子穿越放射冠的通道。穿過放射冠的精子立即與透明帶接觸，頂體酶隨后將透明帶溶出一條孔道，精子借自身運(yùn)動(dòng)穿越透明帶，并接觸卵黃膜。在精子觸及卵黃膜的瞬間，會(huì)產(chǎn)生阻止后來的精子進(jìn)入透明帶帶的生理反應(yīng)，這個(gè)反應(yīng)稱為透明帶反應(yīng)。它是防止多個(gè)精子進(jìn)入透明帶，引起多精子入卵受精的第一道屏障。由于卵黃膜表面有很多微絨毛,，當(dāng)精子與卵黃膜接觸時(shí)，立即被微絨毛抱合，隨后精子外膜與卵黃膜相互融合，精子入卵。精子入卵后，卵黃膜會(huì)立即發(fā)生一種生理反應(yīng)，拒絕其他精子在進(jìn)入卵內(nèi)，這種生理反應(yīng)稱為卵黃膜封閉作用，這是防止多精子入卵的第二道屏障。精子入卵后的另一變化，是尾部脫離，并且原有的核膜破裂；隨后精子洗=形成一個(gè)新的核膜，最后形成一個(gè)比原來精子還大的核，叫做雄原核。于此同時(shí)精子入卵后被激活的卵子完成減數(shù)第二次分裂，排出第二個(gè)極體后，形成雌原核，雌原核一般略小于雄原核。雌雄原核發(fā)育而完成后，相向移動(dòng)，彼此接觸，二者體積縮小、合并，兩組核染色體為一組，形成一個(gè)含二倍染色體的核子，即完成受精過程。胚胎發(fā)育：1、 發(fā)育起始：合子形成后在輸卵管內(nèi)進(jìn)行有絲分裂，開始發(fā)育。2、 早期發(fā)育：該時(shí)期胚胎發(fā)育是在透明帶內(nèi)進(jìn)行的，該時(shí)期特點(diǎn)是細(xì)胞的分裂方式為有絲分裂，細(xì)胞的數(shù)量不斷增加，但體積不變，甚至縮小，該時(shí)期稱為卵裂期。根據(jù)胚胎的形態(tài)變化，早期胚胎發(fā)育分為：桑甚胚、囊胚和原腸胚三個(gè)時(shí)期。桑甚胚當(dāng)胚胎細(xì)胞達(dá)到32個(gè)左右時(shí)，胚胎形成致密的細(xì)胞團(tuán)，形似桑甚，叫做桑甚胚，這個(gè)階段的每一個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育成完整胚胎的潛能，屬于全能細(xì)胞。囊胚桑甚胚進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞開始分化。聚集在胚胎一端，個(gè)體較大的細(xì)胞稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將來發(fā)育成胎兒的各種組織，沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列的、個(gè)體較小的細(xì)胞，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞，將來發(fā)育成胎膜和胎盤。當(dāng)胚胎發(fā)育到胚胎的內(nèi)部含有液體的囊腔即囊胚腔時(shí)，這個(gè)時(shí)期的胚胎稱為囊胚。囊胚進(jìn)一步擴(kuò)大，會(huì)導(dǎo)致透明帶破裂，胚胎從其中伸展出來，這一過程叫做孵化。原腸胚囊胚孵化后，再進(jìn)一步發(fā)育，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)表層的細(xì)胞發(fā)育成外胚層，下方的細(xì)胞發(fā)育成內(nèi)胚層，這時(shí)期的胚胎稱為原腸胚，有內(nèi)胚層包圍的囊腔叫做原腸腔。滋養(yǎng)層則發(fā)育成胎兒的胎膜和胎盤。體外受精和早期胚胎培養(yǎng)體外受精的主要步驟:卵母細(xì)胞的采集、精子的獲取、受精等。卵母細(xì)胞的采集和處理：1、對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如鼠、兔、以及家畜等常用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后從輸卵管沖洗卵子，直接與獲能的精子在體外受精；對(duì)于大型家畜常從屠宰場或己屠宰母畜的卵巢中采集卵母細(xì)胞，也可以借助超聲波探測儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡等工具，直接從活體動(dòng)物的卵巢中獲取卵母細(xì)胞。采集的卵母細(xì)胞要在體外人工培養(yǎng)成熟后才能與獲能的精子受精。精子的采集和獲能收集精子的方法：假陰道法、手握法、電刺激法。假陰道法是采用仿生學(xué)的方法，模仿發(fā)情雌性動(dòng)物陰道環(huán)境設(shè)計(jì)的裝置，他能滿足雄性動(dòng)物交配時(shí)對(duì)壓力、溫度、潤滑度的要求，同時(shí)配有與采精動(dòng)物相適應(yīng)的活臺(tái)畜或假臺(tái)畜.手握法不需要任何設(shè)備,徒手或戴上乳膠手套，直接把握雄性動(dòng)物的陰莖，給予適當(dāng)?shù)膲毫痛碳?，就可引起射?這種方法只適合豬和犬等體型較小，易控制的家畜.電刺激法是將動(dòng)物麻醉后，用特制的電極伸入動(dòng)物的直腸，直接刺激位于腰薦部得射精中樞神經(jīng)，引起射精,這種方法常用于野生或經(jīng)濟(jì)動(dòng)物.精子的獲能精子獲能常采用的方法:培養(yǎng)法和化學(xué)誘導(dǎo)法。對(duì)于嚙齒動(dòng)物、家兔和豬等動(dòng)物的精子，一般采用培養(yǎng)法，即將取自附睪的精子，放入人工配制的獲能液中，培養(yǎng)一段時(shí)間后精子就可獲能；對(duì)于牛羊等家畜等家畜的精子常采用化學(xué)法，即將精子放在一定濃度的肝素或鈣離子載體A23187溶液中，用化學(xué)方法誘導(dǎo)精子獲能。受精把獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵子放入獲能溶液中或?qū)Ｓ玫氖芫芤褐型瓿墒芫^程。胚胎的早期培養(yǎng)精子與卵子在體外受精后，應(yīng)將受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育能力。哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)液的成分一般比較復(fù)雜，除一些無機(jī)鹽和有機(jī)鹽類外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核昔酸等營養(yǎng)成分以及血清的物質(zhì)。當(dāng)胚胎發(fā)育到適宜的階段時(shí)就應(yīng)該取出向受體移植或冷凍保存。不同動(dòng)物胚胎移植的時(shí)間不同，牛羊一般培養(yǎng)到桑甚胚階段或囊胚階段才進(jìn)行移植，小鼠家兔等試驗(yàn)動(dòng)物可在更早的階段移植，人的體外受精胚胎即試管胚胎可在8-16細(xì)胞移植。胚胎工程的應(yīng)用及前景胚胎移植：是指將雌性動(dòng)物德爾早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式的到的胚胎,移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動(dòng)物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)。胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)：第一，哺乳動(dòng)物發(fā)情排卵后，不管是否妊娠，在一段時(shí)間內(nèi)，同種動(dòng)物的供受體生殖器官的生理變化是相同的，這就為供體的胚胎移入受體提供適宜的生理環(huán)境。第二，哺乳動(dòng)物早期胚胎形成后，在一定時(shí)間內(nèi)不會(huì)與母體子宮建立組織上的聯(lián)系，而是出于游離狀態(tài)，這位胚胎的收集提供了可能。第三，大量的研究已經(jīng)證明，受體對(duì)移入子宮的外來胚胎不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能。第四，供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯(lián)系，但移入受體的供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受任何影響。胚胎移植主要包括：對(duì)供體受體的選擇和處理，配種或進(jìn)行人工受精，對(duì)胚胎的收集、檢查、培養(yǎng)或保存，對(duì)胚胎進(jìn)行移植以及移植后的檢查等步驟。牛胚胎移植的基本程序：1、對(duì)供體、受體母牛進(jìn)行選擇，并用激素進(jìn)行同期發(fā)情處理。2、用激素對(duì)供體母牛做超數(shù)排卵處理。3、超數(shù)排卵的母牛發(fā)情后，選擇同種優(yōu)秀的公牛進(jìn)行配種或人工受精。4、胚胎的收集：配種或受精后第七天，用特制的沖卵裝置，把供體母牛子宮內(nèi)的胚胎沖洗出來（即沖卵）。5、沖卵后，對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量檢查，這時(shí)的胚胎應(yīng)發(fā)育到桑甚胚或囊胚階段。6、將收集的胚胎直接向受體移植或放入-196°C的液氮中保存。7、胚胎的移植：手術(shù)法，引出受體子宮和卵巢，將胚胎注入子宮角，縫合傷口；非手術(shù)法，將裝有胚胎的移植管送入受體母牛子宮的相應(yīng)部位，注入胚胎。8、對(duì)受體母牛進(jìn)行是否妊娠的檢查。9、受體母牛產(chǎn)下胚胎移植的犢牛。胚胎分割：是指采用機(jī)械方法將早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術(shù)。、胚胎分割所需要的主要儀器設(shè)備是：實(shí)體顯微鏡和顯微操作儀。進(jìn)行胚胎分割時(shí)，應(yīng)選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的桑甚胚或囊胚。胚胎干細(xì)胞（ES或EK細(xì)胞）是由早期胚胎或原始性腺分離出來的一類細(xì)胞。ES細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性，在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小，細(xì)胞核大、核仁明顯；在功能上，具有發(fā)育的全能性，即可以分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種組織細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞可以增殖而不發(fā)生分化。ES細(xì)胞是研究體外細(xì)胞分化的理想材料。ES細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在添加抑制因子的培養(yǎng)液中，能夠維持不分化的狀態(tài)，在培養(yǎng)