年4月19日大腸桿菌PCR檢測(cè)方法文檔僅供參考ICSFORMTEXT11.220FORMTEXTB41FORMTEXTDBFORMTEXT21DBFORMTEXT21/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXTFORMTEXT大腸桿菌PCR檢測(cè)方法FORMTEXTMethodofPCRforthedetectionofEscherichiacoliFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXTFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙鳳菊，關(guān)淼，關(guān)乃鵬，李清竹，陳瑤大腸桿菌PCR檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大腸桿菌PCR檢測(cè)方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大腸桿菌的診斷、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬糞便、臟器及純培養(yǎng)物中大腸桿菌的檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第302號(hào)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。E.coli：大腸桿菌（Escherichiacoli）DNA：脫氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：堿基對(duì)（basepair）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）原理根據(jù)E.coli保守基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。儀器和器材本技術(shù)規(guī)范中需應(yīng)用下列儀器和器材：高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最大離心力12000g以上）、冰箱、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、分析天平、1.5mL離心管和0.2mL離心管、微量移液器和吸頭等。試劑和材料DNAzol?Reagent：DNA抽提試劑，外觀為淡綠色，于4～8℃保存。無(wú)水乙醇：-20℃預(yù)冷。75%乙醇：用無(wú)水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。DNA聚合酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。dNTP(2.5mmol/L)。引物：引物濃度為20μmol/L；上游引物序列為5’-GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’，下游引物序列為5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’。陰性對(duì)照：滅菌雙蒸水陽(yáng)性對(duì)照：E.coliATCC25922。無(wú)菌生理鹽水。TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液，溴化乙錠。DLDNAMarker。注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無(wú)菌的容器分裝。操作步驟樣品的采集、前處理、存放與運(yùn)輸采樣注意事項(xiàng)采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。采樣工具藥匙、15mL離心管和1.5mL離心管經(jīng)121（士2）℃均高壓滅菌20min；剪刀、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h。內(nèi)臟樣品的采集與前處理采取病死或剖殺豬主要臟器（肝臟、脾臟、肺臟）裝入滅菌15mL離心管中，編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)室。稱(chēng)取1g病料進(jìn)行研磨，然后加入1mL無(wú)菌生理鹽水，混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。內(nèi)容物的采集與前處理采取病死或剖殺豬的小腸內(nèi)容物，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入無(wú)菌生理鹽水，混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。糞便的采集與前處理用藥匙無(wú)菌采取發(fā)病豬新鮮糞便，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入無(wú)菌生理鹽水，混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。血液無(wú)菌采集心血，按1：1倍體積加入無(wú)菌生理鹽水，混勻，轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中編號(hào)備用。大腸桿菌純培養(yǎng)物挑取37℃18～24h培養(yǎng)的典型菌落，用1mL無(wú)菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。然后轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中編號(hào)備用，待檢。保存與運(yùn)輸采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免重復(fù)凍融(凍融不超過(guò)3次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6～8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。PCR檢測(cè)DNA提取取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照管數(shù)+陰性對(duì)照管數(shù)，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。每管加入800μLDNAzol，分別加入被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各200μL，顛倒混勻后，4℃1g離心10min。取與7.2.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，吸取900μL上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入500μL無(wú)水乙醇混勻后。4℃1g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL75%乙醇，洗滌。4℃1g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。如此洗2次。4000g離心10s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min。加入20μL經(jīng)高壓處理的水，輕柔混勻，溶解管壁上的DNA，冰上保存?zhèn)溆?；若需長(zhǎng)期保存應(yīng)放置-70℃冰箱。PCRPCR反應(yīng)體系建立25μL反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專(zhuān)用離心管中：滅菌蒸餾水17.375μL10×PCRBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLExTaqDNA聚合酶0.125μL上游特異性PCR引物0.5μL下游特異性PCR引物0.5μLDNA2μLPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DLDNAMarker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物），緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。結(jié)果判定紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)在272bp擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為判定依據(jù)。被檢樣品出現(xiàn)272bp擴(kuò)增條帶為E.coli核酸陽(yáng)性，未出現(xiàn)272bp擴(kuò)增條帶的樣品判為E.coli核酸陰性。

（規(guī)范性附錄）

試劑配制電泳緩沖液（50倍）A.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.1.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸)電泳緩沖液(50倍)羥基甲基氨基甲烷(Tris)（分析純)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0)100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋使用。1%瓊脂糖凝膠瓊