精品資料豬胰蛋白酶的分離純化與鑒定3、掌握胰蛋白酶活力測定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)二、實驗原理2+胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動物胰臟中，在Ca的存在下，被腸激2+酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷本實驗以豬胰臟為材料，首先用酸性水溶液抽提組織，在Ca2+離子存在條胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸)的羧基羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋精品資料水解濾液在波長280nm處光吸收的增值與胰蛋白酶的活力單位成正比。測定中以標氨酸在280nm處光吸收值相同時的酶量為一個蛋白酶活力單位(U)。三、試劑和器材 10%(V/V)HAc溶液 (3)2.5mol/LH2SO4 5mol/LNaOH (5)2mol/LHCl (6)0.001mol/LHCl H量取41mL0.01mol/L檸檬酸溶液(2.10gH3C6H5O7H2O/L),加入59mL0.01mol/L檸檬酸鈉溶液(2.9gNa3C6H5O72H2O/L)混勻，用酸度計檢查pH值是否為5.0。 (8)0.05mol/L,pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液：量取8.2mL0.05mol/L檸檬酸溶液(10.5gH3C6H5O7H2O/L),加入11.8mL0.05mol/L檸檬酸鈉溶液(14.705gNa3C6H5O72H2O/L)混勻，用酸度計檢查pH值是否為5.0。精品資料 (9)0.1mol/L,pH6.0，檸檬酸鈉緩沖液：酸度計檢查pH值是否為6.O。室溫后，加上述緩沖液40mL,用1NHCl小心調(diào)pH為8.0，用緩沖液mL。Ha.0.1M磷酸氫二鈉的配制:稱取Na2HPO412H2O(358.14g/mol)17.9070g加水定容至500mLb.0.1M磷酸二氫鈉的配制:稱取NaH2PO42H2O(156.01g/mol)7.8005g加水定容至500mLc.二者互兌至相應(yīng)pH值s用3NHCl調(diào)至所需pHmL精品資料m0.1MNaCO3-NaHCO3緩沖液：pH9.5、10.0、10.5a.0.1MNaCO3的配制:稱取NaCO35.2995g加水定容至500mLb.0.1MNaHCO3的配制:稱取NaHCO34.2005g定容至500mLc.二者互兌至相應(yīng)pH值13)SDS(聚丙烯酰胺凝膠電泳)所需試劑(無需配制)①30%儲備膠溶液：將29.0g丙烯酰胺(Acr)和1.0gN-N亞甲雙丙烯酰胺(Bis)溶于60mL水中，于37C溶解，molLTris—HCl(pH8.8):Tris18.17g力卩ddH20溶解，濃dHO酸調(diào)pH至6.8，定容至100mL。pH00mL。⑤10%過硫酸銨(AP)：100mgAP加ddH2O至1mL。精品資料⑦10＞電泳緩沖液(pH8.3):Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS8%SDS,0.4%溴酚蘭1.0ml,⑨考馬斯亮藍染色液：考馬斯亮藍(R-250)0.25g,甲醇225mL,mLddH2O225mL。2、材料3、儀器四、實驗方法精品資料離心10000rpm,15min用4層紗布過濾得上清液(將研細的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻，使溶液中最終含有0.1mol/LCaCI2加入極少量豬胰蛋白酶(約2-5mg)，輕輕攪拌均勻用5mol/LNaOH調(diào)pH為8.0于25C下活化4~6小時(2小時取樣一次)，測定酶活性增加的情況 mL，及時SDS化)量取體積，加入固體硫酸銨達到75%飽和度，靜置過夜粗胰蛋白酶 (2)透析SDS化)精品資料II待胰凝乳蛋白酶峰過后，改用0.1mol/L,pH6.0，檸檬酸鈉緩沖液洗脫，此時出現(xiàn)再生柱子(0.5MNaOH-0.5MNaOH)I用蒸餾水洗至呈中性分析儀分別測定蛋白質(zhì)A精品資料1mL pHmL液的濃度，一般粗胰蛋白酶為10?80購/mL，純化胰蛋白酶約為6?20?/mL)mL反應(yīng)rminmin精品資料L加入酶液(與體系1濃度相同)1mL應(yīng)3000r/min,10min精品資料胰蛋白酶活力的計算胰蛋白酶活力單位數(shù)tC______每個樣品管中酶液的濃度(mg/mL)V每個樣品管中酶液體積(mL)t反應(yīng)時間(min)各階段(粗酶液留樣1，酸沉淀后酶液留樣2,胰蛋白酶原樣品留樣3,胰酶激4，離子交換層析后活力較高樣品留樣5)的純化效果用12%的五.實驗數(shù)據(jù)的記錄精品資料粗提液(留樣1)胰酶激活后(留樣4)透析后上柱前樣品(留樣5)(mL)略A蛋蛋白含量(mg/mL)A280)精品資料11357A性為縱坐標，制作雙坐標圖的離子交換層析曲線。(以管數(shù)為橫坐標、以蛋白含量及活性為縱坐標，制作雙坐標圖的離子交換層析曲3?測定粗酶液、胰酶激活后樣品、離子交換層析收集管中樣品液的體積及酶活力,活后樣品后上柱前樣品比活4.SDS電泳結(jié)果精品資料？報(自然科學(xué)版)，2005,10(4):300—3041.硫酸銨溶液飽和度計算表(0°C)0①51.648.445.242.038.735.5258.15.42.70固體硫酸43.640.537.434.331.228.0銨的克數(shù)"47.644.441.238.134.931.7升溶液加39.836.833.730.627.624.5毫36.133.130.127.124.121.1308.25.52.75每32.629.626.623.720.74022.68.469.766.262.759.255.752.2358.35.6060.357.053.650.346.943.6565.061.558.154.751.247.8555.952.649.346.042.739.54525.822.920.0029.126.223.320.420.95.32.600510152025硫酸銨初濃度%飽和度精品資料303540455055606570758085909502.85.602.808.65.72.908.75.82.908.95.93.009.06.03.0021.49.26.13.10024.921.89.36.23.1028.525.422.29.56.33.2032.329.125.822.69.76.53.2036.232.929.626.323.09.96.63.336.933.530.226.323.520.16.73.4044.541.037.634.230.827.323.120.56.83.4048.845.341.838.334.831.327.924.420.9.03.502.SDS①分離膠(12%)的配制(4mL):ddH20TrisHCIpH.04mL精品資料EMED玻璃板0.04mLL以水封頂，注意使液面平(凝膠完全聚合需30-60min)。②積層膠的配制(1mL):