MaAThesisSubmittedToGansuAgriculturalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsMasterDegreeSupervisor:Prof.ZhangLiFacultyofAnimalScience&TechnologyGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,P.RCommencementinMay, 不同繁殖性能綿羊BMPR-IBmRNA英文縮 英文全 中文名

Marker-assistedselectionPolymorphicinformationcontenttativetraitlociRestrictedfragmentlengthpolymoephismSodiumdodecylsulfateSingleNucleotidePolymorphismsFolliclestimulatinghormonePolymerasechainreactionEthylenediaminetetraaceticacid,disodiumsaltStatisticalpackageforthesocialscienceGenerallinearmodelBasepairDeoxyribonucleicacidRibonucleicacidMillimolarconcentrationRevolutionsperminuteAgaroseGelElectrophoresisNationalCenterofBio-informationLuteinizinghormoneBonemorphogeneticproteinreceptorsSinglestrandconformationpolymorphismAdisintegrinandmetalloproteasewiththrospondinTrisBoricacidEDTAAcidcitratedextrosePhosphateBuffered

標記輔助選擇多態(tài)信息含量數(shù)量性狀位點單核苷酸多態(tài)促素促Tris硼酸電泳緩沖液TE 子標記技術廣泛地應用于綿羊的初期篩選，大大提高了選擇的效率和準確和ADAMTS-1遺傳多態(tài)性進行分析，并利用生物信息學技術對綿羊的產(chǎn)羔數(shù)進行相關聯(lián)分析；運用實時熒光定量PCR技術對ADAMTS-1在綿羊不同組織進行表達量分析，對于影響綿羊繁殖力的候選ADAMTS-1在轉錄綿羊BMPR-IB編碼區(qū)864位點多態(tài)性及產(chǎn)羔數(shù)相關分試驗羊品種檢測到三種型AA、AB、BB，該編碼區(qū)第846位點發(fā)生T>C的突變。湖羊母羊以及小尾寒羊母羊的優(yōu)勢型均為AA型，而羊母羊和高山細毛羊母羊AB型頻率略高于AA型四種綿羊的優(yōu)勢等羊母羊和高山細毛羊母羊信息含量處于中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）。顯羊中差異呈現(xiàn)顯著（P<0.05）。BMPR-IB編碼區(qū)第846位點突變在不同繁綿羊BMPR-IB3′部分非編碼區(qū)多態(tài)性及產(chǎn)羔數(shù)相關分擴增發(fā)現(xiàn)，非編碼區(qū)511位點雜合C>T，在CG型中，非編碼區(qū)544位點雜合C>G，發(fā)現(xiàn)三種型CC、CT、CG。在高山細毛羊母羊群體中，CT型對于產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響（p值），而在其他兩個群體中不同型對于產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著（p值），而CT型對綿羊ADAMTS-1mRNA在不同組織間差異表達及第五外顯子多態(tài)性分析根據(jù)綿羊8個組織進行表達量分析可知所有群體的表達量顯著高于其垂體、下丘腦。小尾寒羊多胎母羊的表達量是羊雙胎母羊的1.54倍、羊單胎母羊的2.61倍。通過對ADAMTS-1第五外顯子分析可知，在編AB、AC，顯著性分析可知三種型均對產(chǎn)羔數(shù)不顯著。所有綿羊群體χ2檢驗表明均處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，PIC值屬于低度中度多態(tài)有重要的影響，初步認定是羊和小尾寒羊的多羔主效。綿羊；BMPR-IB；ADAMTS-1；產(chǎn)羔數(shù)；PCR-SSCPLittersizeisthemostimportanteconomictraitsinsheep,butthelittersizetraitheritabilityislowthresholdtraits,thetraditionalmethodsimprovementprogresshasbeenslow.Atpresent,withtheemergenceofnewbiotechnology,especiallymolecularmarkertechnologyiswidelyusedintheinitialscreeningofsheep,greatlyimprovingtheefficiencyandaccuracyofselection.ThisexperimentusingPCR-SSCPanddirectsequencingofBMPR-IBgeneandADAMTS-1genegeneticpolymorphismysisoftheeffectoffecundityofsheep,Andysisoflittersizeinsheepwereassociatedwithbiologicalinformationysis,TheexpressionofADAMTS-1geneindifferenttissuesofsheepwasyzedbyreal-timefluorescenttativetechnique,andtheeffectofADAMTS-1geneonthetranscriptionlevelwasverified.Theresearchaimedtoprovidesomereferenceforimprovingthesheepfecundity.Theresultsareas1ysisofPolymorphismat864LocusofBMPR-IBGeneCDSRegionandRelationshipwithLitterSizeinSheepTheresultsshowedthattherewerethreekindsofgenotypeAA,ABandBBintestedsheepbreeds,andT>Cmutationoccurredincodingregionof846.AAwasthedominantgenotypeinSmallTailHanewesandHuewes,whileABwasthedominantgenotypeinMongoliaewesandGansualpinemerinoews.Awasthedominantallelesinallfoursheepsamples.Theχ2andG2valuesofSmallTailHanewes,GansualpinemerinoewesandHuewesdidnotreachedthesignificantlevel(p>0.05),buttheχ2andG2valuesofMongoliaewesreachedthesignificantlevel(P<0.05),whichindicatedthatthreeotherewesallfittedwithHardy-WeinbergequilibriumexceptMongoliaewes.TheobservedvalueFoffoursheepbreedsinBMPR-IBgenewereinthe95%confidenceinterval,andclosertotheon-line.AccordingtothePICamongdifferentbreedswecouldgetthatSmallTailHansheepandHusheepbelongtolowpolymorphism(PIC<0.25),whileMongoliasheepandGansualpinemerinosheepbelongtomoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).SignificanttestshowedthatGansualpinemerinosheephadsignificantdifferenceswithSmallTailHansheepHusheep,andMongoliasheephadsignificantdifferenceswiththeotherthreesheepbreeds(P<0.05).Themutationoccurredin846siteinBMPR-IBgenecodingregiondistributeddifferentlyinewegroupswithdifferentfecundity,whichmeantthatthislocuscouldbeconsideredasapotentialmolecularmarkerinsheep.2ysisofPolymorphismatPartial3′UTRBMPR-IBGeneandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreeds341sheepinthreesheepbreedstotal,usingpolymorphismdetectionin3sheep'partofthenonencodingregionwasamplified,511heterozygousC>TinCGgenotype,544heterozygousnonencodingregionofC>G,foundthreegenotypesofCC,CT,CG.InAlpineMerinoewesgroup,CTgenotypehasasignificanteffectonlittersize,anddifferentgenotypesintheothertwogroupsinthelittersizewasnotaffected,butthegenotypeofCTinsheeplambingmarkerneedsfurthervalidation.DifferentialExpressionofSheepADAMTS-1GeneinDifferentTissuesandysisofExon5PolymorphoismTheysisofexpressiontyof8organsindicatedthattheexpressionofovaryinallgroupswassignificantlyhigherthanotherorgans,andtheexpressionleveloftherestorgansrankedfromhightolowwaskidney,heart,liver,lung,spleen,pituitary,andhypothalamus.TheexperimentshowedthattheovaryexpressionofADAMTS-1geneinSmallTailHanewes(multiple-births)was1.54and2.61timesofthatinMongoliaewes(twinbirths)andMongoliaewes(singlebirth)respectively.BasedontheADAMTS-1exon5geneysis,wefoundthatC1506TandG1509AappearedintheCDSregion,whichbothbelongedtothesynonymousmutation.ThreebandswerenamedasAA,ABandAC,andthesignificantysisindicatedthatthesethreegenotypeswerenotsignificantonlittersize.Theresultsofχ2fitnesstestshowedthatallsheeppopulationswereinHardy-weinbergequilibriumstate,andPICvaluebelongedtointermediateandmoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).TheresultsofthisexperimentindicatedthatADAMTS-1geneyedanimportantroleonthelittersizeofMongoliaewesandSmallTailHanewes,whichwaspreliminarilyconsideredastheprolificacymajorgeneofthetwo.:sheep；BMPR-IB；ADAMTS-1；Littlersize；PCR-SSCP；Q-摘 第一章文獻綜 遺 營 ......................................................................................................................... DNA標 RFLP技 PCR-SSCP技 RAPD技 BMPR-IB研究進 ADAMTS-1研究進 相對定量分析（Relativefication, 利用內參進行標準化處 相對定量結果分析方 第二章綿羊BMPR-IBCDS區(qū)864位點多態(tài)性及其產(chǎn)羔數(shù)相關性分 第三章綿羊BMPR-IB部分3端非編碼區(qū)多態(tài)性及產(chǎn)羔數(shù)相關分 第四章綿羊ADAMTS-1在不同組織間差異表達及第五外顯子多態(tài)性分 致 作者簡 擇出各類優(yōu)質遺傳資源的綿羊品種。我國的綿羊存欄率約占世界存欄量的單羔，數(shù)綿羊品種的綿羊可四季、一胎產(chǎn)雙羔或多羔。綿羊的繁殖性能是決定綿羊業(yè)生產(chǎn)效益的重要因一繁殖性能的高低直為畜牧業(yè)生產(chǎn)重要經(jīng)濟性狀之一對于家畜來說其繁殖力的高低直接影響生新技術直接定位動物重要的經(jīng)濟性狀分子標記以及相關聯(lián)候選得到廣泛的羊BMPR-IB和ADAMTS-1多態(tài)性位點之間的相關性，同時運用實時熒光定量分析法對ADAMTS-1在不同綿羊品種組織間的mRNA表達量進品種是日照季節(jié)且產(chǎn)單羔綿羊繁殖力較低嚴重制約我國綿羊生產(chǎn)年和高繁殖力是綿羊和持續(xù)發(fā)展的基礎因此如何有效提高綿羊繁殖Booroola[3]，上述品種都具備常年且一胎多羔的優(yōu)良性狀。不同的綿羊品種表現(xiàn)出的繁殖力也不盡相同我國北方牧區(qū)的綿羊品飼養(yǎng)水平的高低直接影響綿羊的繁殖力增加母羊的率的措施是對配種前的母羊進行短期優(yōu)飼。維生素的缺乏也會導致率的下降。母羊的產(chǎn)羔隨著的增加而增加初產(chǎn)母羊的平均產(chǎn)羔數(shù)顯著低于經(jīng)產(chǎn)母羊，3-65-67歲種的遺傳多樣性，利用遺傳多樣性規(guī)律有利于物變異和一系列相關應用。DNA序列多態(tài)性，由于其數(shù)據(jù)不僅穩(wěn)定且信息量巨大，不受環(huán)境等外界因素干DNA標記。：與否及在間表達的差異可以反映出群體的遺傳狀況蛋白質的標記主要包括兩類蛋白的標記和同工酶酶標記法。利用同工酶在組中對應座的具置，同工酶標記可以劃分為：等位同工酶和復等位同工酶。：DNADNA分子標記是一類利用物種自身核酸序列為基礎的標記技術，且堿分子標記技術已經(jīng)被廣泛應用于生物技術的方方面面[6-8]。根據(jù)技術的不同DNA標記可以分為以下三類[9-11]Southern雜交技術為分子標記；第二代，以PCR技術為的分子標記；第三代，是利RFLP根據(jù)這些片段反映出組中不同酶切位點分布的狀況，此技術最早是由Grodzicker等[12]于1974年建立的，RELP標記具有穩(wěn)定性好、等位共顯性、一次就可以標記處大量的位點等優(yōu)勢。RELPDNA的推廣[13]PCRRELPPCR-SSCP1984年Noumi[14等大腸桿菌野生型和突變型1-TPase利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電（SC發(fā)現(xiàn)野生型與突變型的1-TPase在凝膠電泳中的遷移率有差異這一研究結果為變異的檢測提供了理論基礎和技術支持而后在1989年Orita等[5,16人利用這項技術進行多態(tài)性的檢測并且SSCPPCR技術的普及和發(fā)展，Hoshino等[171992年對電泳后的凝膠染色進行了改良，提出利用銀染法可以快速便捷的判定P-SSP技術建立并且日趨純熟。P-SSCPA或者RNA80PR技術進行的第三代分子標記技術，其原理是利用軟件設計某一物種組DNAPR設備進行目的片段特異性擴增，而后用擴增的目的片段在高溫（9℃）進行變性處理，使得之前的DNA雙鏈結構變成單鏈構象，變性后的兩條單鏈結構因其堿基序列有一定的差DNA中堿基序列出現(xiàn)變異（堿基的替換、缺失或者插入）從而導致在泳道中的遷移率有一定差異從而檢測出不同相同片段的遺傳多態(tài)性。PCR-SSCPDNA純度要求不高等優(yōu)點，但該檢測手法只是一種較為初步的檢測，判型后還需要進一步。若產(chǎn)物存在污染則會出現(xiàn)假陽性，導致判型。由于大樣本直接費用過于昂貴，而此技術對于大樣本的檢測成本較低，且在前的初次篩查有一定的輔助意義，因此可避免盲目導致的經(jīng)費浪費[18,19]。RAPDRAPDWnliamsWelsh1990DNA多態(tài)檢測技術[20,21]。RAPD檢測DNA多態(tài)性的獨特方式很快滲透于定位、遺傳[22]RAPD基本原理是利用一系列隨機排列的寡聚核酸（8～10個堿基）為引物，再通過PCR對靶DNA，顯影。由于引物結合組上的特定位點組上被結合的特定區(qū)域如果發(fā)生，PCR引物退火溫度低且允許一定的程序錯配，RAPD引物的通用性較好可以適用于不同生物組分析每次反應只需要一個引物就可以擴增出許DNA（4）RAPD技術成本低且引物通用性好，可以在不同物種間進行檢測[24]RAPD技術的不足：（1）RAPDDNA模板濃度、Mg2+濃度、實驗重復性差和穩(wěn)定性不高[25]；（2）RAPD分子標記通常可以識別顯性標記，對于雜合位點識別能力較差[26]，使得該技術在定位或者連鎖圖譜的繪制上的準確性下降；（3）由于條帶遷移的速度問題，不同果一個在同樣的位置出現(xiàn)條帶這可能是多個大小一致的條帶所造RAPD技術的應用造成多方面的制約[27]。綿羊BMPR-IB和ADAMTS-1研究概BMPR-IB研究進骨形態(tài)受體蛋白IB作為轉移生長因子β亞基(TGF-Β)受體的成員之一，是近年來研究較為熱門的綿羊多羔主效。BMPR-IB在綿羊體內垂體、、耳、骨骼、、下丘腦、等組織中都具有較高的表達，同時參與GDF-5(Growthdifferentiationfactor-5)、BMP-2(Bonemorphogeneticprotein-2)、BMP-4(Bonemorphogeneticprotein-4)、BMP-6(Bonemorphogeneticprotein-6)及BMP-15(Bonemorphogeneticprotein-15)的信號轉導過程[28]BMPR-1BCDS1509bp502個氨基酸殘基，并被定位于綿羊第6號的4q22-23區(qū)間。BMPR-IB在不同物種間序列差異較小氨基酸序列高度保守，編碼一個TGF-β亞基，是調節(jié)細胞分化和生長的一類多功，能蛋白質，并且存在多種細胞中。大量研究表明BMPR-IB被確定為綿羊高繁殖效，新西蘭和法國學者發(fā)現(xiàn)Booroola綿羊BMPR-IB在編碼區(qū)發(fā)生A>G突變使氨基酸子發(fā)生改變，導致編碼的氨基酸由谷氨酰胺變成精氨酸（Q249R），BMPR-IB的胞內激酶信號區(qū)中，致BMPR-IB蛋白受體部分失活，最終導致其功能無法正常進行[29-31]。此次突變FecBBooroola綿羊擁有較高的繁殖力。在這一發(fā)現(xiàn)之后FecB在其他綿羊品種都有證實的Garole羊群[32]。2003FecB突變[33]。楊華等的研究結果可知FecB突變同樣也出現(xiàn)美利奴羊，對于羊群的產(chǎn)羔數(shù)有顯著地影響[34]。小鼠敲除BMPR-IB則會導致小鼠不育，可能是因為缺失型小鼠的，發(fā)現(xiàn)缺失BMPR-IB的小鼠會出現(xiàn)生產(chǎn)不規(guī)律的周期和假孕現(xiàn)象，同時還觀察到細胞周圍的顆粒細胞數(shù)目明顯少于野生型的小鼠-IB缺失突變導致小鼠顆粒細胞分泌芳香化酶能力顯著減弱，而在動物合成雌激鍵的作用，中此類酶缺失是導致機體不孕的原因之一。的影響較為明顯其功能主要表現(xiàn)在對孕酮分泌起到抑制作用或者對顆粒分化的調控。BMPR-IB是影響動物繁殖力的主效因子，對于深入研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白及受體在提高動物育種的效率和降低育種的成本有著重要促進意ADAMTS-1研究進哺乳動物的解聚蛋白樣金屬蛋白酶ADAMTS共有十九個蛋白水解酶構成，參與了多種病理與生理活動的過程，例如外基質的組裝和降解、生成、血管生成、止血過程、關節(jié)炎和等[37]。近年來的相關研究發(fā)現(xiàn)，各類均與ADAMTS-1有著緊密的聯(lián)系ADAMTS-1可以影響腫瘤轉移和增生。在[38,39]、結腸癌[40]、肺癌[39]和軟骨癌[41]等一系列中都有ADAMTS-1的發(fā)現(xiàn)。ADADMTS成員最早是作為小鼠炎癥的上調，其沒有跨膜結構域并且存在I型TSP基序[42,43]。ADAMTS-1作為成員之一，是在小鼠結腸26細胞中克隆得到的cDNA序列[44]ADAMTS-1可以分泌到細ECM蛋白調節(jié)[45,46]。ADAMTS-1通過C-末端金屬蛋白酶亞結構與ECM蛋白結合，降解蛋白聚糖、蛋白多糖和多功能蛋白聚糖[47]，ADAMTS-1ADAMTS-1究中[49]，例如動脈硬化[50]，心肌梗塞[38]，腦缺血中[51]ADAMTS-1對上述疾病存在著一定的關聯(lián)。ADAMTS-1對孕酮的合成有一定的影響，并且可以合成孕酮，其的表達與LH/HCG的合成有很大的關系，與此同時在顆粒細胞的表達中直接影響囊狀的生成ADAMTS-1在雌性動物的卵丘細胞與細胞中均有表達此對于細胞的能育性有一定影響[52]Richards等[47]以敲除ADAMTS-1的小鼠為試驗樣本，結果表明被敲除ADAMTS-1的雌鼠與對照組相比，敲除ADAMTS-1的雌鼠官畸形進而表現(xiàn)為繁育能力低下，其壁變厚，且存在許多旋繞；內出現(xiàn)大量的異常發(fā)育的包囊；較對照組成熟數(shù)量下降明顯，導致不能，注射hCG與PMSG后仍不孕。此類現(xiàn)象只發(fā)生在雌鼠中，在公鼠并不影響其繁殖性能[53]ADAMTS-1基因在雌性動物的調節(jié)過程中起著重要的作用。近年來，在國內鮑建軍等[54]以小尾寒羊、洼地綿羊、羊和湖羊為試驗對象，通過ADAMTS-1的外顯子SNP位點與產(chǎn)羔性狀進行分析研究；孫振梅等[55]和張瓊娣[56]等以黔北麻羊、黑和半細毛羊為試驗對象構建DNA樣本池通過后續(xù)生物信息學分析可知，SNPs位點的突變對的RNAADAMTS-1可能會影響產(chǎn)羔性狀。實時熒光定量PCR熒光定量PCR技術是PE公司于1995年研發(fā)成功的一種具有性意Q-PCRPCR時的一類技術，再利用每個樣品的Ct值對模板的相對定量或者利用標準曲CtPCRPCRCtQPCRPCRPCR擴增的產(chǎn)物，把已知Q-PCR可以得到不同Ct值可以繪制出標準曲線。如果在一個實驗中不到的Ct值帶入系統(tǒng)生成出標準曲線中用以計算未知濃度的樣品起始模板量、QPCR相對定量分析法廣泛應用于拷貝數(shù)的變化檢測中以及目的的mRNA表達水平的檢測領域中。而絕對定量法應用于微生物和等微生物的定、內參是指一類維持基本機能在不同樣本中的拷貝數(shù)基本保持不變的一類核酸序列常的內參有β-atinGPDACTSDH28sRNA1、18sRNA等。反轉錄試劑盒cDNA合成率的差異等，如果不進行統(tǒng)一標準化處理得到的數(shù)據(jù)樣本的相對濃度目 目的以及內參在不同批次的檢測過程中出現(xiàn)靈敏度不一致出現(xiàn)這種的原因可能與探針復性、淬滅系數(shù)和熒光能量轉移（FET）效率的差異有一定的關系。一般選擇典型的陽性樣本（內參和目的均呈現(xiàn)陽性這類樣本一般具有 過處理正常組織起始時間點等特點校正樣本歸一化處理的相對濃度是利用每個樣本的目的和內參的比值除以校正樣本同一目的與內參的比值[60。：內 濃內 濃內 濃

待測（待測樣本）待測（校正樣本2-△△CtReal-timePCR最為常見的一類分析方法。此類方法的特點量），5PCR擴增反應過程中保證穩(wěn)定不變。目的的Ct值ΔCt(sample)=Ct(target,sample)－Ct(reference,ΔCt(calibrator)=Ct(target,calibrator)－Ct(reference,ΔCtΔCt=2－△△t

experimentalgroup：實驗組；controlgroup：對照組；Ct：目標擴增產(chǎn)物達第二章綿羊BMPR-IBCDS區(qū)864位點多態(tài)性及所需的羊由省永昌縣養(yǎng)殖示范戶提供小尾寒羊由隴西縣菜子鎮(zhèn)旺旺母羊養(yǎng)殖農民專業(yè)合作社提供，高山細毛羊由張掖市肅南縣畜牧站提供，湖羊由武威三洋農牧公司提供羊只均為2~3歲產(chǎn)胎胎次2~3胎的成年經(jīng)產(chǎn)母羊為試驗羊，經(jīng)頸靜脈血樣后肝素鈉抗凝，血樣于-20°C保存?zhèn)溆?。TapDNA聚合酶、DL2000LadderMarker、DL750LadderMarker、Biowest烷基硫酸鈉（SDS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris堿二水乙二胺蘇州金唯智生物科技合成。100mlACD7:1pH8.0100mL高壓滅菌備用。（3）細胞裂解液：蔗糖11.01g，MgCl20.102g，1mol/LTris-HCl1mL，Triton1mL100mL。0.294g，Na2EDTA·2H2O0.375g，SDS1g，1mol/LTris-HCl1mL100mL。1綿羊組DNA的提綿羊血液組DNA提取方法參照見附錄PCR本試驗中所用引物均利用Olig6.0和Primer5.0引物設計軟件相結合而設根據(jù)已經(jīng)公布的綿羊BMPR-IBmRNA序列（GenBank登錄號: 列見表2-1。表2-1BMPR-IB部分多態(tài)位點引Table2-1PolymorphismLociPrimerofBMPR-IB引 引物序列

864位鎂離子的濃度等。PCR反應的優(yōu)化是為了獲得最佳擴增效率的條件，而且還要PCRDNA以及引物質量的下，維持其他條件不變，僅改變其中任意一個條件，將該PCRPCR25μL2-2PCRTable2-2PCRamplification試劑名 劑dd 10×PCRLoading Primer Taq 模板 共 PCR2-3PCRTable2-2TheBestamplifiedreactionprogramof數(shù)PCR2.2.3.1。1×TBE電泳緩沖液。7uL的變性劑，3uLPCRPCR管中混勻?；靹蚝蟮?0°C恒溫箱中，140V，18mA，3W，4固定結束后，加入適量的銀染液，在搖緩慢搖動7min。再用蒸餾水漂2-4Table2-4FormulofPolyacrylamide30%液10%210根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，人工判斷型PCRPCR利用PopGene32軟件計算等位頻率、遺傳雜合度（He）和有效等位基信息含量檢測利用PIC軟件檢測；對于后的結果利用MEGA（version5.0）軟件分析。采用SPSS19.0軟件分析綿羊產(chǎn)胎數(shù)與型之間的顯著性。頻率是指在一個群體中某一等位的數(shù)量與所占據(jù)同一座的全部等位總數(shù)的一個比率。頻率如下：p(A)

q(B)

nAB是該群體中AA、BB和AB型的個數(shù)型頻率是一個群體中某個型的數(shù)所占全部數(shù)的百分比。型的為：型頻率=型個數(shù)/檢測群體總數(shù)。哈代-溫伯格定律（Hardy-Weinberg平衡）是在一個隨機交配的大群體中，對于一個處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)的群體，在一個座位具有兩個 nAB′=(nAA+nAB+nBB)HnAA′=(nAA+nAB+nBB)PnAB′=(nAA+nAB+nBB)Q

HoHoi

；

HeHe1iiNe i中，Ne為有效等位數(shù)，Pi為第i個有效等位頻率多態(tài)含在連鎖分析時，的多態(tài)性通常利用多態(tài)信息含量來表示，當PIC>0.5時屬于高度多態(tài)，0.25<PIC<0.5屬于中度多態(tài)，PIC<0.25屬于低度多態(tài)。多態(tài)信息含量如下： m1PIC1P22P2i

i1j中，Pi和Pj分別表示第i個和第j個等位在群體中的頻率，n表示某一特定位點上等位數(shù)。將DNA組樣品，用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(圖2-1)。條帶單一無雜帶，DNA完整性較好，可以進入下游試驗。圖2-1綿羊血液組DNA檢Figure2-1GenomicDNAdetectionofsheepBMPR-IBPCR目的產(chǎn)物擴bp符合預期。圖2-2綿羊BMPR-IB引物P1PCR產(chǎn)Figure2-2P1PCRamplificationofBMPR-IBgeneinPCR-SSCPSSCPP1和B兩個等位，并且存在3種帶型，分別為AA、BB、AB(圖2-3)圖2-3綿羊BMPR-IBSSCP檢Figure2-3SSCPdetectionofBMPR-IBgeneinAA、BB、AB帶型的樣品各取兩份送去測序公司發(fā)現(xiàn)1020位點(編碼區(qū)864)出現(xiàn)突變T>C序列比對及峰值(圖2-4、2-5)。圖2-4綿羊BMPR-IB編碼區(qū)序列對Figure2-4ThecomparisonofBMPR-IBgenecodingsequencesofinAA型(AABB型(BBAB型(AB圖2-5綿羊BMPR-IBAA型、AB型、BB型比Figure2-5SequencecomparisonofAA,ABandBBgenotypesofsheepBMPR-頻率和型頻、對于六個綿羊群體（小尾寒羊多胎母羊、湖羊多胎母羊羊單雙胎母羊多胎母羊以及小尾寒羊多胎母羊的優(yōu)勢型均為AA型而羊單雙胎母羊和高山細毛羊單雙胎母羊AB型頻率略高于AA型綿羊的優(yōu)勢等位基因均為A。小尾寒羊多胎母羊、高山細毛羊單雙母羊、湖羊多胎母羊的χ2值和G2值均未達到顯著水平（p>0.05）,而羊單雙胎母羊的χ2值和G2值達單雙胎母羊多態(tài)信息含量處于中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）（2-6）。、、、利用SPSS21.0軟件對BMPR-IB的編碼區(qū)864位點的三種不同的分布差異性檢測(表2-7)。檢測所得可知在高山細毛羊單胎母羊和小尾寒羊多胎母羊之間高山細毛羊單胎母羊和羊單胎母羊之間高山細毛羊單胎母羊和羊單胎母羊之間、高山細毛羊單胎母羊和、、、、、高山細毛羊單胎母羊和湖羊多胎母羊之間高山細毛羊雙胎母羊和小尾寒羊多胎母羊之間高山細毛羊雙胎母羊和羊單胎母羊之間高山細毛羊雙胎母羊和湖羊多胎母羊之間羊單胎母羊和湖羊多胎母羊之間、蒙母羊和羊雙胎母羊之間差異顯著（0.01<P<0.05）。而在高山細毛羊單胎母羊和高山細毛羊雙胎母羊之間、羊單胎母羊和羊雙胎母羊之、、、在不同型間最小二乘積所得如下。AA型、AB型、BB型2.4703(1.2166)、1.7347(0.8357)、1.3846(0.5064)。兩兩進行獨立T檢驗比較可知AA型和AB、BB差異極顯著不同型與品種互作效應的最小二乘積分析，3種型與四種綿羊有種互作效應(羊小尾寒羊湖羊無BB型高山細毛羊×AA(A×AA)、、 、、尾寒羊×AA(S×AA)3.0000、小尾寒羊×AB(S×AB)3.0000、羊×AA(M×AA)3.5333。不同型與品種之間互作效應后多重比較(表2-8)，A×AB與A×AA之間、A×BBM×AB之間、H×AAH×AB之間差異不顯著（P>0.05），其表2-5型和頻Table2-5GenotypeandalleleAB小尾寒羊多胎母 SmallTailHanewes(multiple羊單胎母 0000Mongoliaewes(single羊雙胎母 Mongoliaewes00高山細毛羊單胎母 Gansualpinemerinoewes(single80.550高山細毛羊雙胎母 Gansualpinemerinoewes湖羊多胎母 500

樣本量/Sample

Genotype

等 頻AlleleHuewes(multiple2-6Table2-6Geneticpolymorphism品 多態(tài)信息含

χ2Probabilityof

G2Probabilityof

觀測F

95%95%Confidence小尾寒羊多胎母 SmallTailHanewes(multiple羊單胎母 Mongoliaewe(single羊雙胎母 Mongoliaewes高山細毛羊單胎母 Gansualpinemerinoewes(single高山細毛羊雙胎母 Gansualpinemerinoewes湖羊多胎母 Huewes(multiple表2-7不同型在綿羊群體中的分布差異檢Table2-7Testofthedistributionofdifferentgenotypesinsixsheep GansualpinemerinoewesSmallTailHanewesMongoliaewe(singleMongoliaewesHuewes(multiple高山細毛羊單胎母 0.886<0.000Gansualpinemerinoewes(single高山細毛羊雙胎母 <0.000Gansualpinemerinoewes小尾寒羊多胎母 —SmallTailHanewes(multiple羊單胎母 ——Mongoliaewe(single羊雙胎母 ———Mongoliaewes注AA代表不顯著P>0.05,AB0.01<P<0.05,AC代表差異極顯著P<0.01。表內代表PNote:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentP表2-8品種與型互作與不同產(chǎn)胎類型綿羊分布差異的獨立樣本檢Table2-8Testof ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming品種型————————————————————————————注：A×AA高山細毛羊×AA型;A×AB高山細毛羊×AB型;A×BB高山細毛羊×BB型;S×AA小尾寒羊×AA型;S×AB小尾寒羊×AB型;M×AA羊×AA型;M×AB羊×AB型;H×AA湖羊×AA型;H×AB湖羊×AB型Note:A×AAindicatesGansualpinemerinoewesandAAgenotype;A×ABindicatesGansualpinemerinoewesandABgenotypy;A×BBindicatesGansualpinemerinoewes×BBgenotypy;S×AAindicatesSmallTailHanewes×AAgenotypy;S×ABindicatesSmallTailHanewes×ABgenotypy;M×AAindicatesMongoliaewe×AAgenotypy;M×ABindicatesMongoliaewe×ABgenotypy;H×AAindicatesHuewes×AAgenotypy;H×ABindicatesHuewes×ABgenotypy、在多種組織中都存在BMPR-IB的表達，該是調節(jié)和分化的重要蛋白受體。近年來，研究資料顯示，BMPR-IB對于的調節(jié)主要在于抑制其分泌酮或控制顆粒細胞的分化成熟，進而間接影響動物的繁殖[61]。FecB的數(shù)增加，研究推測該突變可能導致對激素的敏感程度提高[62]，路復雜和功能多樣性導致對調節(jié)機制的過程并不明確而且目前研究中對于綿羊編碼區(qū)中的同義突變較少。本試驗通過利用直接法和PCR-SSCP技術，對高山細毛羊單雙胎母羊羊單雙胎母羊、小尾寒羊多胎母羊和456只綿羊中，都存在AA型和AB型，而在高山細毛羊單、雙胎勢均為AA，在羊單、雙胎母羊和高山細毛羊單、雙胎母羊中發(fā)現(xiàn)ABAAPIC多態(tài)信息含量可知，屬于低度多態(tài)的是小尾寒羊多胎母羊和湖羊多胎母羊(PIC<0.25)，而在羊單雙胎母羊和作為連鎖分析的標記位點，對提高選育高產(chǎn)胎率的綿羊有一定的價值。G2χ2現(xiàn)象可能與選育的有直接關系且受自然選擇和人工選育影響較大。、綿羊的繁殖性狀屬于低遺傳力性狀之一由于該性狀是受主 與微效，因相節(jié)控制的因此對于尋找主效多胎品系以此提高綿羊的繁殖性能有著重要的意義。有資料顯示，BMPR-B是湖羊、小尾寒羊等高繁殖性能綿羊的主效[65。在中等繁殖力的綿羊品種中并不存在Q249R突變，本次試驗就四456BMP-IB864T>C種型B該點突變屬于同義突變并沒有引起氨基酸的變化，且不同型在四種綿羊品種中分布差異不同高山細毛羊與小尾寒羊湖羊間差異極顯著(<0.01)；羊與小尾寒羊、湖羊間差異極顯著(<0.01)；甘肅高山細毛羊和羊之間的差異也存在顯著性(0.01<0.05)但高繁殖力綿羊品種湖羊與小尾寒羊中差異并不明顯(>0.05)。利用品種和產(chǎn)胎數(shù)互作后與基后子由A變?yōu)镚，成為稀有子，導致蛋白翻譯速度減慢，并且構象產(chǎn)生一定的差異，在特定情況下導致顆粒細胞的分化和細胞的發(fā)育[66因此可確定編碼區(qū)864突變可作為控制綿羊繁殖性狀的分析標記位點。，456BMPR-IB其中只有在高山細毛羊中發(fā)現(xiàn)BB型，而其他群體均只有兩種型AA、BMPR-IB編碼區(qū)864位點的突變在不同繁殖力綿羊品種間差異明顯，第三章綿羊BMPR-IB部分3端非編碼區(qū)多態(tài)性2.2.1試驗樣品2.2.2DNA的提取2.2.3綿羊血液樣品的檢測本試驗中所用引物均利用Olig6.0和Primer5.0引物設計軟件相結合BMPR-IB3端非編碼區(qū)引物設根據(jù)已經(jīng)公布的綿羊BMPR-IBmRNA序列（GenBank登錄號: 列見表3-1。表3-1BMPR-IB部分多態(tài)位點引Table3-1PolymorphismLociPrimerofBMPR-IB引 引物序列 退火溫

3′430bpPCR同第二章同第二章PCR同第二章同第二章同第二章BMPR-IBPCR目的產(chǎn)物擴BMPR-IB引物P2引物擴增產(chǎn)物條帶清晰無雜帶（圖3-1），大小分別150bp符合預期大小圖3-1綿羊BMPR-IB引物P2PCR產(chǎn)Figure3-1P2PCRamplificationofBMPR-IBgeneinPCR-SSCPCC、CT、CG(3-2)。圖3-2綿羊BMPR-IBSSCP檢Figure3-2SSCPdetectionofBMPR-IBgeneinCC、CT、CG帶型的樣品各取兩份送去測序公司，三種型CC、CT、CG進行分析，在CT型中，BMPR-IB3端非編碼區(qū)第511位點雜合C>T，在CG型中，非編碼區(qū)544位點C>G（3-4）。CC型(CCCT型(CTCG型(CG圖3-4綿羊BMPR-IBCC型、CT型、CG型比Figure3-4SequencecomparisonofCC,CTandCGgenotypesofsheepBMPR-IB頻率和型頻、對于三種綿羊品種（小尾寒羊多胎母羊羊單雙胎母羊和高山細毛羊單雙胎母羊341SSCP分析所得如下(3-2)等位均為C。高山細毛羊雙胎母羊、羊單胎母羊綿羊χ2值和G2值均未達到顯著水平（P>0.05）,而羊雙胎母羊、高山細毛羊單胎母羊、小尾寒羊多胎母羊的χ2值和G2值達到顯著水平（P<0.05）。說明羊雙胎母羊高山細毛羊單胎母羊小尾寒羊多胎母羊群體Hardy-weinberg平衡狀態(tài)。五個綿羊群體的觀測值F在BMPR-IB中均處于95%置信區(qū)間內，且接近于、PIC多態(tài)信息含量可知，屬于中度多態(tài)的是高山細毛羊表、SPSS21.0BMPR—IB3′430bp580bp擴增后三種型分布差異檢測(表3-4)。高山細毛羊單胎母羊和高山細毛羊雙胎母羊高山細毛羊單胎母羊和羊單胎母羊之間、高山細毛羊單胎母羊和羊雙胎母羊之間差異極顯著（P<0.01）。高山細毛羊單胎母羊與小、表3-2型和頻Table3-2Genotypeandallele 樣本量/只Sample

Genotype

等位頻AlleleCTGCTG90.0.599Mongoliaewes(singleMongoliaewesGansualpinemerinoewes(singleGansualpinemerinoewes3-3Table3-3Geneticpolymorphism品 多態(tài)信息含

χ2Probabilityof

G2Probabilityof

觀測F

95%95%ConfidenceSmallTailHanewes(multipleMongoliaewe(singleMongoliaewesGansualpinemerinoewes(singleGansualpinemerinoewes表3-4不同型在綿羊品種中的分布差異檢Table3-4Testofthedistributionofdifferentgenotypesinfivesheep

Gansualpinemerinoewes

SmallTailHanewes(multiple

Mongoliaewe(single

Mongoliaewes高山細毛羊單胎母 Gansualpinemerinoewes(single高山細毛羊雙胎母 Gansualpinemerinoewes小尾寒羊多胎母 —SmallTailHanewes(multiple羊單胎母 ——Mongoliaewe(single注AA代表不顯著P>0.05,AB0.01<P<0.05,AC代表差異極顯著P<0.01。表內代表PNote:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentP在不同型間最小二乘積所得如下。CC型、CT型、CG型之間的最小二乘積及標準差分別為1.63(0.689)、1.96(0.723)、1.50(0.675)。兩兩進行獨TCTCC、CG3.512(0.0005)、4.328(<0.0001)。CCCG1.456(0.1470)。種互作效應(表3-5)。高山細毛羊×CC(A×CC)1.49、高山細毛、 、、、 、、之間互作效應后多重比較(4)，A×CCA×CT之間、A×CCM×CC之間、A×CCM×CT之間、A×AAM×CG之間、A×CTM×CC之間、A×CT與M×CT之間、A×CTM×CG之間、A×CTM×CC之間、S×CCS×CT之間、S×CCS×CG之間、S×CTS×CG之間、M×CCM×CG之間、M×CCM×CT之間、M×CTM×CG之間差異不顯著（P>0.05），A×CCA×CG之間、A×CGM×CC之間、A×CGM×CG之間差異顯著（0.05<P<0.01），表3-5品種與型互作與不同產(chǎn)羔類型綿羊分布差異的獨立樣本T檢Table3-5Testof ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming型———14.537(<0.0001 8.434(<0.0001)AC7.063(<0.0001)AC7.836(<0.0001)AC 0.218(0.8280)注：高山細毛羊×CC型;高山細毛羊×CT型;高山細毛羊×CG型;S×CC注：高山細毛羊×CC型;高山細毛羊×CT型;高山細毛羊×CG型;S×CC小尾寒羊×CC型;S×CT小尾寒羊×CT型;S×CG小尾寒羊×CG型;羊×CC型;M×CT湖羊×CT型;M×CG羊×CGNote:A×CCindicatesGansualpinemerinoewesandCCgenotype;A×CTindicatesGansualpinemerinoewesandCTgenotypy;A×CGindicatesGansualpinemerinoewes×CGgenotypy;S×CCindicatesSmallTailHanewes×CCgenotypy;S×CTindicatesSmallTailHanewes×CTgenotypy;S×CGindicatesSmallTailHanewes×CGgenotypy;M×CCindicatesMongoliaewe×CCgenotypy;M×CTindicatesMongoliaewe×CTgenotypy;M×CGindicatesMongoliaewe×CGgenotypy。，、的3′端非編碼序列在轉錄后的加工過程中起著調控的作用其中涉mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率等一系列生理進程的調節(jié)，國內外目前關于對BMPR-IB的非編碼序列鮮有涉及[67,68]。賈立新等[69]對BMPR-IB部分3′非編碼區(qū)序列進行直接和PCR-SSCP技術檢測高繁殖力和低繁殖力綿變。目前研究認為，在轉錄調控區(qū)域主要集中在的5′端，也就是說5′3′mRNA的轉錄后和翻譯水平的調控并非必須[70]的3′端非編碼區(qū)包含大量的堿基有著豐富的遺傳信息[70]。3′miRNA中，存在3種型，CC型、CT型和CG型，在3′非編碼序列第511位點和544位點發(fā)生了C>T突變和C>G的突變，第430bp到580bp擴增后三種型分布差異檢測高山細毛羊單胎和高山細毛羊雙胎之間高山細毛羊單胎和羊單胎之間、高山細毛羊單胎和羊雙胎之間差異極顯著。，、；；在不同型間最小二乘積所得結果如下：CC型、CT型、CG型之間的最小二乘積及標準差分別為1.63(0.689)、1.96(0.723)、1.50(0.675)。兩兩進行獨立TCTCCCG3.512(0.0005)4.328(<0.0001)。CCCG1.456(0.1470)。由于試驗有局限性，得出的結果僅增發(fā)現(xiàn)，存在CC、CT、CG三種型。個群體中不同型對于產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著，而CT型對于高山細毛羊產(chǎn)羔第四章綿羊ADAMTS-1在不同組織間差mRNA試驗所需的羊由省永昌縣養(yǎng)殖示范戶提供小尾寒羊由隴西縣菜子鎮(zhèn)母羊養(yǎng)殖農民專業(yè)合作社提供，頸靜脈血樣，用ACD抗凝管-20°C保存；另外分別期的羊單胎母羊(4只)、羊雙胎母羊(4只)和小尾寒羊多胎母(4只)的、垂體、下丘腦、心臟、脾臟、肺臟、肝臟、自Takara寶生物公司(大連)。1綿羊組DNA的提同第二章2.2.2綿羊組DNA的提RNA提取按照，按試劑盒（寶生物）DNARNA2.2.3.14.2.3.2同第二章2.2.3.2體積RNase反轉錄操作按照RT體積RNase將以上組分混勻，42℃2min

體積Reactionsolutionfrom RNase 15min85℃PCR擴增。參照GENEBANK中綿羊ADAMTS-1(登錄號GU437212)cDNA全序列，使用Primer5.0設計引物。以β-actin(NM_ )作為內參(表4-1)。引物由蘇州生物科技合成。4-1Table4-1primer

Accession

Primer

Product

鎂離子的濃度等。PCR反應的優(yōu)化是為了獲得最佳擴增效率的條件，而且還要PCRDNA以及引物質量的下，維持其他條件不變，僅改變其中任意一個條件，將該PCRPCR25μL4-2PCRTable4-2PCRamplificationddPrimerTaqPCR

4-3PCRTable4-3TheBestamplifiedreactionprogramofYBRRPremixExTaqTMⅡ反轉錄酶(10μM)10μl(TaKaRa, )和μlRNase-ddH2O。分析熒光定量溶解曲線，判斷是否存在引物二聚體，以4°C，30s。PCR同第二章同第二章頻率和型頻表達量通過2-△△Ct計算[76]。不同組織中ADAMTS-1表達量，P<0.05，所得數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(n=10)表示。心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、下丘腦、垂體、8個組織ADAMTS-1基(4-1)。圖4-1綿羊母羊ADAMTS-1在8種組織的RT-PCR電Figure4-1RT-PCRelectrophoresispatternofADAMTS-1genein8organsof注:1;2心臟;3肝臟;4肺臟;5脾臟;6下丘腦;7垂體;8腎Note:1ovary;2heart;3kidney;4lung;5spleen;6hypothalamus;7pituitary;8利用實時熒光定量PCR法對綿羊ADAMTS-1在三個綿羊群體8個組織中的表達量進行定量分析，用實時熒光定量PCR法對綿羊ADAMTS-1在8組織中表達量進行分析，內參B-actin和目的ADAMTS-1溶解曲線(圖4-2)，可知兩個擴增產(chǎn)物的Tm值均一，溶解曲線上呈現(xiàn)明顯的單峰，說明Q-PCR反應過程中，兩種引物擴增特異性效果良好，沒有出現(xiàn)非特異性擴增AB圖4-2綿羊ADAMTS-1和B-actin的溶解曲Figure4-2MeltingcurveforsheepADAMTS-1geneandB-actin綿羊AAMTS-1的表達水平，三個綿羊群體的表達量高于其他組織（<0.05）,其余組織由高往低表達水平依次是腎臟、心臟、肝臟、肺臟、脾臟、垂體、下丘腦(圖4-3)。同一組織不同綿羊表達水平分析可知，中小尾寒羊多胎母羊與羊單胎母羊、羊雙胎母羊表達量差異顯著羊雙胎母羊和羊單胎母羊差異顯（<0.05且小尾寒羊多胎的表達量是羊雙胎母羊的1.54倍、羊單胎母羊的2.61倍。其余組織間差異不顯著。AB圖4-3綿羊ADAMTS-1在三個羊群中各組織的mRNA表達水Figure4-3TheexpressionmRNAlevelofADAMTS-1geneindifferentorgansofthreekindsof注:A中不同小寫字母表示同一組織在不同綿羊群體下的表達量差異顯著(p<0.05,mean±S.E.);B中不同大寫字母表示同一綿羊群體下不同組織中的表達量差異顯著(p<0.05,N=10,mean±S.E.)Note:DifferentlowercaselettersinAindicatesthattheexpressionofthesameorganwassignificantlydifferent(p<0.05,N=10,S.E.+mean)indifferentsheeppopulations;DifferentcapitallettersinBindicatesthattheexpressionlevelsofdifferentorgansinthesamesheeppopulationweresignificantlydifferent(p<0.05,N=10,mean+S.E.)依據(jù)試驗目的所設計的引物分別對綿羊血液組樣品進行擴增，利用2％4)4-4ADAMTS-1Figure4-4ThePCRdetectionofsheepADAMTS-1geneexonSSCPP1存在單核苷酸多態(tài)性，產(chǎn)生圖4-5綿羊ADAMTS-1第五外顯子SSCP檢Figure4-5SSCPdetectionofsheepADAMTS-1geneexon峰值(4-6)。AA型(AAAB型(ABAC型(AC圖4-6綿羊ADAMTS-1第五外顯子AA型、AB型、AC型比Figure4-6SequencecomparisonofAA,ABandACgenotypesofsheepADAMTS-1geneexon對于三個綿羊群體(小尾寒羊多胎母羊、羊單雙胎母羊)共計115樣本羊信息含量處于中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）(4-5)。表4-4型和頻Table4-4Genotypeandallele品 樣本量/

等位頻SampleGenotypeAlleleABC4SmallTailHanewes(multiple62Mongoliaewes(singlebirth)羊雙胎羊雙胎母羊Mongoliaewes(twins)

4-5Table4-5Geneticpolymorphism品 多態(tài)信息含量

群體雜合度

有效等位數(shù)

卡方檢驗值 PPolymorphisminformationPopulationheterozygosityEffectivenumberofalleleChi-squaretestProbabilityofSmallTailHanewes(multipleMongoliaewe(singleMongoliaewes綿羊品種和型及品種與型互作后對產(chǎn)胎數(shù)的影響進行方差分析，所得數(shù)據(jù)表明，不同型之間F=0.140，差異不顯著（P=0.840P>0.05）不小二乘均數(shù)羊AA型1.498，羊AB型1.541，羊AC型1.500，小互作分析(表4-6)，可知小尾寒羊三種型與羊三個型互作差異極顯著（P<0.01），而各自品種間型互作不顯著（P>0.05），說明型對于綿表4-6品種與型互作與不同產(chǎn)羔類型綿羊分布差異的獨立樣本T檢Table4-6Ttestof ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming品種×

__________注:S×AA小尾寒羊×AA型,S×AB小尾寒羊×AB型,S×AC小尾寒羊×AC,M×AA羊×AA型,羊×AB型,M×AC羊×ACNote:S×AAindicatesSmallTailHanewes×AAgenotype,S×ABindicatesSmallTailHanewes×ABgenotype,S×ACindicatesSmallTailHanewes×ACgenotype,M×AAindicatesMongoliaewe×AAgenotype,M×ABindicatesMongoliaewe×ABgenotype,M×ACindicatesMongoliaewe×ACgenotypeADAMTS-1不僅在雌性官的發(fā)育中起著重要作用，同時還在類的ADAMTS-1缺失也會影響女性能力下降等，表明ADAMTS-1是過程中的重要蛋白酶，對于提升人類繁殖能力意義十分重要，把ADAMTS-1當作高繁殖力候選可以提高優(yōu)良品種的選育工作效率。國內學者對于AAMT-1響繁殖性狀有相關，徐姍姍等利用P-REP技術發(fā)現(xiàn)豬的ADAMTS-1第七外顯子豬產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)性狀顯著相關[77。樂凱根據(jù)獲得的豬的AAMT-1的A序列，用眉山豬和大白豬A模版進行克隆，發(fā)現(xiàn)兩個SP位點，位于第七外顯子72bpC>G和第七內含子512bpG>。本試驗利用P-SSCP技術和直接法，發(fā)現(xiàn)在綿羊AAMT-1第外顯子，編碼區(qū)1506bp和1509bp分別出現(xiàn)C>、G>A突變共有三種型A(C1506)A(G1509A)發(fā)現(xiàn)三個綿羊群體(小尾寒羊多胎母羊、羊單胎母羊、羊雙胎母羊)共計15個樣本中三個綿羊群體均處于Hardy-weinbeg衡狀態(tài)說明羊和小尾寒羊均已適應當?shù)丨h(huán)PIC（0.25<PIC<0.5表明三個群體在該位點的遺傳變異高，選擇余地較大不同母羊產(chǎn)胎性狀與型相關性分析可知小尾寒羊三種型與羊三個型互作差異極顯著（P<0.01）,而各品種間型互作不顯（>0.05說明型對于綿羊的產(chǎn)胎數(shù)影響不顯著而品種對于產(chǎn)羔數(shù)影響極顯（<0.01就AAMTS-1第五外顯子兩個突變位點而言其對綿羊產(chǎn)胎數(shù)沒有顯著影響。牛的ADAMTS-1在牛前期的中存在表達研究發(fā)現(xiàn)促激素在前期有明顯的提升，分析整個期的ADAMTS-1轉錄水平可知，整個期ADAMTS-1都有表達，但在早期提取出的組織中表達量顯著高于其他時期[79]。Doyle等[80]ADAMTS-1PRC/EBPSp1/Sp3結合區(qū)域聯(lián)合調控的，LH通過活化腺嘌呤環(huán)化酶并且產(chǎn)生cAMP調節(jié)ADAMTS-1，說明PR和組蛋白的Sp1/Sp3結合區(qū)域對于誘導PR來調節(jié)，說明LH和PR調節(jié)ADAMTS-1在顆粒細胞的表達是各自獨立的通路卻又相互協(xié)調本次試驗利用期的三個綿羊群體并結合實時熒光，、可知中小尾寒羊多胎母羊與羊單胎母羊羊雙胎母羊表達量差異顯（<0.05羊雙胎母羊和羊單胎母羊差異顯（<0.05且小尾寒羊多胎表達量是羊雙胎母羊的1.54倍羊單胎母羊的2.61倍。對于羊單雙母羊群體表達水品差異分析結果與何小龍等[81]所得相同，并且發(fā)現(xiàn)小尾寒羊多胎母羊表達量顯著高于羊單雙胎群體其余組織的表達量差異不顯著。，、的表達量是羊雙胎母羊的1.54倍、羊單胎母羊的2.61倍，說明ADAMTS-1對綿羊多胎性狀有重要的影響作用。在三個群體共計115只綿羊，ADAMTS-1外顯子5中發(fā)現(xiàn)三種型，AAAB、AC，但是通過與產(chǎn)胎數(shù)互作分析后發(fā)現(xiàn)三種型對產(chǎn)胎數(shù)影響不顯著本試驗利用PCR-SSCP技術對于六個已知產(chǎn)胎數(shù)的綿羊群體BMPR-IB864BMPR-IB編碼區(qū)864位點發(fā)生T>C的突變，屬于同義突變。對于不同羊）與低繁殖力品種（羊母羊、高山細毛羊母羊）分布差異較為顯著。該非編碼區(qū)間都存在兩個突變（BMPR-IB非編碼區(qū)第511位點雜合C>T，BMPR-IB部分非編碼區(qū)的多態(tài)性與三個群體的產(chǎn)羔數(shù)進行相關性分析個綿羊品種中不同型對于產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著，而CT型對于高山細毛羊本次試驗利用實時熒光定量分析法對不同羊品種組織間ADAMTS-1差異表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)小尾寒羊多胎母羊的表達量是羊雙胎母羊的1.54倍、羊單胎母羊的2.61倍，初步確定ADAMTS-1在轉錄水平對于綿羊CDS區(qū)（編碼區(qū)）1506C>T、1509G>A，均屬于同義突變，三種帶型分別命名為AA、AB、AC，顯著性分析可知三種型LiuH,WangX,WarburtonML,etal.Genomic,Transcriptomic,andPhenomicVariationRevealstheComplexAdaptationofModernMaizeBreeding.[J].分子植物(Molecularnt),2015,8(6):871-884.Wild,J.P.(1984).Sheepandman.趙有璋(2011).羊生產(chǎn)學.