抗雙鏈DNA抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床免疫室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號:XXX生效日期：共頁第頁1.目的規(guī)范檢測血清或血漿中抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體的流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。2.原理2．1·間接免疫熒光法：包被有綠蠅短膜蟲的生物薄片和稀釋的血清樣本溫育。如果樣本是陽性的，特異性IgG、IgA和IgM抗體與鞭毛蟲抗原結(jié)合。在第二次溫育時，熒光素標(biāo)記的抗人抗體與結(jié)合在生物基質(zhì)上的抗體反應(yīng)，形成熒光顯微鏡下所觀察到的特異性熒光模式。孔板中孵育。如果患者樣品中有相應(yīng)抗體，就會與抗原結(jié)合。洗去未結(jié)合的部分，然后加入HRP標(biāo)記的二抗，使其與微孔板中的抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)。洗去未結(jié)合的酶標(biāo)。加入TMB底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色深淺與相應(yīng)抗體量成正比。AdsDNA性微粒上包被的鏈霉親和素(SA)反應(yīng)，形成反應(yīng)復(fù)合物，在磁場作用下，未結(jié)合的物質(zhì)被洗滌液洗去，加入吖啶標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體(二抗)進(jìn)行反應(yīng)，與第一步孵育的復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，形成抗原抗體二抗復(fù)合物，在反應(yīng)混合物中加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，樣本中的抗dsDNAIgG的量和分析儀光學(xué)系統(tǒng)測定到的相對光單位數(shù)(RLU)呈正比。3.標(biāo)本要求3．2·樣品收到后立即分離血清，不能及時測定的血清應(yīng)于2~8℃保存。4.試劑與儀器性和陽性對照，熒光顯微鏡。4．3·化學(xué)發(fā)光法試劑與儀器：抗核抗體測定試劑盒，××化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。5.操作步驟鹽(PBS)吐溫緩沖液；待測血樣本用PBS吐溫緩沖液1∶10稀釋。5．1．2加樣：將加樣板放在泡沫板上，將25μl稀釋后的血清樣本加至加樣板的每一反應(yīng)區(qū)上，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。5．1．3溫育：將生物載片有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里，室溫(18~PBS泡至少5min。5．1．5加樣：將20μlFITC標(biāo)記的抗人IgG(熒光二抗)加至潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)上。杯中取出生物載片，用吸水紙擦去背面和邊緣的水分后，立即蓋在加樣板的凹槽里，室溫(18~25℃)溫育30min。玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加封片介質(zhì)至蓋玻片，每一反應(yīng)區(qū)約10μl。從洗杯中取出一張生物載片，用吸水紙擦干背面和邊緣的水分。將生物載片有生物薄片的一面朝下放在已準(zhǔn)備好的蓋玻片上。5．2．2在指定的孔中加入100μl稀釋血清，同時加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或cutoff對照以及陰性和陽性對照。在室溫孵育30min。用洗滌緩沖液洗3次。每孔加入100μl酶標(biāo)。室溫溫育30min。用洗滌緩沖液洗3次。每孔加入100μlTMB底物。避光室溫下溫育30min。每孔加入100μl終止液，450nm讀取吸光度。運(yùn)行。6.校準(zhǔn)定期對加樣槍、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行保養(yǎng)和校準(zhǔn)。關(guān)鍵部件更換或者維修后也需校準(zhǔn)。7.質(zhì)控7．1·間接免疫熒光法：每批次的實(shí)驗(yàn)應(yīng)帶上陰性和弱陽性質(zhì)控物，滴度結(jié)果的在控規(guī)則：陰性質(zhì)控物必須陰性，陽性質(zhì)控物結(jié)果在上下1個滴度內(nèi)。LJ質(zhì)控圖，以Westgard多規(guī)則質(zhì)控分析法判斷在控或失控。7．3·××化學(xué)發(fā)光法：質(zhì)控品至少每24h或每次定標(biāo)后測試一次；質(zhì)控品至少包含兩個濃度水平的待測定物；質(zhì)控結(jié)果應(yīng)落在可接受的范圍內(nèi)，否則結(jié)果無效。8.結(jié)果判斷·間接免疫熒光法：熒光模式(陽性反應(yīng))：間接免疫熒光法檢測抗dsDNA抗體的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)是綠蠅短膜蟲，綠蠅短膜蟲擁有一個只含dsDNA而不含其他細(xì)胞核抗原的動基體。與動基體反應(yīng)的抗體必然是抗dsDNA抗體。如果樣本陽性，則可觀察到鞭毛蟲動基體均質(zhì)和部分環(huán)形熒光。同時，陽性對照必須顯示相同的熒光模式。如果樣本陰性，則動基體不顯示熒光，僅細(xì)胞核、鞭毛基體或細(xì)胞質(zhì)的熒光應(yīng)判斷為陰性(表所示)。表所示IIF檢測抗dsDNA結(jié)果判讀抗體反應(yīng)性結(jié)果結(jié)果解釋1∶10陽性血清中未檢出抗dsDNA抗體提示患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡注：以出現(xiàn)陽性核型的最高稀釋度作為檢測的結(jié)果。8．2·酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)：以抗dsDNA抗體標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測血清抗dsDNA濃度可根據(jù)所測吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。二維碼掃描到分析儀的主曲線校正而來。9.生物參考區(qū)間9．1·對定量實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考區(qū)間。如用文獻(xiàn)或說明書提供的參考區(qū)間，使用前應(yīng)加以驗(yàn)證。反應(yīng)性。視為有反應(yīng)性。10.性能參數(shù)性血清的結(jié)果特異性熒光強(qiáng)度基本一致，陰性血清結(jié)果為陰性。10．1．3批間差異：用2份特征性血清對不同批號的產(chǎn)品進(jìn)行檢測，陽性血清的結(jié)果特異性熒光強(qiáng)度基本一致，陰性血清結(jié)果為陰性。雙鏈DNA，沒發(fā)現(xiàn)與其他自身抗原有交叉反應(yīng)。敏感性：85％的SLE患者可檢測到雙DNA。11.臨床意義抗dsDNA抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)最重要的標(biāo)志性自身抗體，美國風(fēng)濕病學(xué)會已將抗dsDNA抗體陽性列為SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)