食品酶學(xué)多酚氧化酶第1頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第八章多酚氧化酶第2頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月一、多酚氧化酶的名稱和自然界的分布多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧氧化還原酶,EC1.10.3.1)

一類含銅的氧化還原酶，催化鄰-苯二酚氧化成鄰-苯二醌，也能作用于單酚單加氧酶的底物。1、多酚氧化酶的名稱第3頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月多酚氧化酶的共同特征是能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：單酚氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2)漆酶(對苯二酚氧化酶laccase,EC.1.10.3.1)。第4頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)在所說的多酚氧化酶一般是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱。在這三大類多酚氧化酶中，兒茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。第5頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2、植物中多酚氧化酶分布多酚氧化酶是植物中最受注意的一種酶,在葡萄,無花果,棗,茶葉和咖啡豆、可可豆中含量很高,它在這些果實(shí)中起著有益的作用，甚至是形成產(chǎn)品特征性的香氣和色澤所必需的。第6頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月紅茶發(fā)酵（生成茶紅素）、可可粉、葡萄干、梅干、椰棗、無花果。紅茶是全發(fā)酵茶，茶中的多酚物質(zhì)主要是兒茶素經(jīng)多酚氧化酶與過氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶黃素和茶紅素。第7頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月多酚氧化酶在桃,蘋果,香蕉,荔枝,馬鈴薯,蓮藕和萵苣中的含量也是相當(dāng)高,然而它對這些果實(shí)起著不好的作用,易引起褐變,造成變質(zhì)和腐爛,對于果蔬貯存及加工過程中的品質(zhì)有重要影響。第8頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱帶水果50%以上的損失都是由于酶促褐變引起的.同時(shí)酶促褐變也是造成新鮮蔬菜例如萵苣和果汁的顏色變化,營養(yǎng)和口感變劣的主要原因控制果蔬加工和貯藏過程中酶促褐變。第9頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月多酚氧化酶在植物中的含量隨品種不同而有很大變化，在眾多的水果和蔬菜中，橄欖中的多酚氧化酶活力最高。多酚氧化酶的活力分布還取決于果蔬的成熟度。在植物葉片中，很大一部分酶活力集中在葉綠體中，在馬鈴薯塊莖中，幾乎集中在亞細(xì)胞部分中；在新采收的蘋果中，多酚氧化酶幾乎全部存在于葉綠體和線粒體中。第10頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差別很大，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。茶葉中的多酚氧化酶分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)，前者主要存在于細(xì)胞液中，屬可溶態(tài)多酚氧化酶；后者主要存在于葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，與這些細(xì)胞器的膜系統(tǒng)或其他特異部位結(jié)合呈不溶態(tài)。第11頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月二、多酚氧化酶催化反應(yīng)及其作用底物1.催化反應(yīng)多酚氧化酶可以催化兩種不同類型的反應(yīng)：（1）一元酚羥基化，生產(chǎn)相應(yīng)的鄰二羥基化合物第12頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）鄰二酚氧化，生成鄰醌類物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)制：氧首先與酶結(jié)合，然后鄰二酚與酶結(jié)合，接著氫從酚轉(zhuǎn)移到Cu2+形成氫過氧化絡(luò)合物，此結(jié)合物再同第二個(gè)鄰二酚結(jié)合，反應(yīng)中沒有自由基中間物形成。兩種反應(yīng)都需要有分子氧的參與。第13頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月多酚氧化酶蛋白包含兩部分：催化氧化與羥基化羥基化活力容易損失（與小分子輔助因子有關(guān)）酶活力對來源不同的酶有很大差異第14頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

多酚氧化酶催化的氧化反應(yīng)的最初產(chǎn)物鄰位醌將繼續(xù)變化。①相互作用生成高分子量聚合物。②與氨基酸或蛋白質(zhì)作用生成高分子復(fù)合物。③氧化那些氧化還原電位較低的化合物。其中①②導(dǎo)致黑色素的生成，反應(yīng)③的產(chǎn)物是無色的。酶促褐變第15頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.作用底物水果、蔬菜中底物為：一元酚類鄰二酚類（對位二酚也可）（間位二酚不作底物）如：

水果中的兒茶酚

OH

OH

土豆中的酪氨酸

HOCH2CHCOOHNH2

第16頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月重要的天然底物第17頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月影響多酚氧化酶作用的因素一元酚和二元酚取代基的位置較高的底物專一性底物的相對專一性因來源不同而變化第18頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月三、pH和溫度對多酚氧化酶活力影響1.pH對酶活力的影響（1）pH的改變影響酶分子側(cè)鏈上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)，這些基團(tuán)的解離狀態(tài)與酶的專一性及酶分子活力中心的構(gòu)象有關(guān)，從而影響到酶活性中心的高級結(jié)構(gòu)。（2）pH的改變影響底物分子中某些基團(tuán)的解離狀態(tài)，也可能影響到中間產(chǎn)物ES的解離狀態(tài)，影響到ES的形成，從而降低酶活性。第19頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月多酚氧化酶的最適pH(1)最適pH：4～7(2)不同種類，不同品種的果蔬甚至果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶的最適pH也存在差異(3)酶的提取或分離的方法對它的最適pH也有影響(4)測定酶活力時(shí)所采用的底物和緩沖液對酶的最適pH也有影響(5大多數(shù)多酚氧化酶只有一個(gè)最適pH,在一些情況下,有第二個(gè)最適pH最適pH因酶的來源和底物的不同存在較大的差異。第20頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.溫度對多酚氧化酶活力影響不同種類、品種、部位的多酚氧化酶有不同的熱穩(wěn)定性，通常最適溫度在常溫加熱易使酶失活同一來源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的熱穩(wěn)定性低溫下多酚氧化酶的活力也有明顯的下降，但活性下降比較緩慢第21頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月四、多酚氧化酶的激活劑、抑制劑和果蔬酶促褐變的防止1.激活劑植物中存在的多酚氧化酶在天然狀態(tài)下一般以非活性形式存在?？梢酝ㄟ^高鹽處理、機(jī)械損傷、酸堿刺激或在尿素、表面活性劑、蛋白酶以及胰酶的作用下活化。激活機(jī)制主要包括：增溶作用、同工酶的互變和分子修飾作用，以及酶-抑制劑復(fù)合物的分離和蛋白酶的水解等使酶構(gòu)象發(fā)生變化。第22頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.抑制劑和果蔬酶促褐變的防止多酚氧化酶活性的抑制方式：化學(xué)抑制：硫脲、EDTA、巰基乙醇、亞硫酸鈉、檸檬酸、抗壞血酸、4-羥基苯甲酸酯等。物理控制：改變貯藏環(huán)境的氣體成分、熱處理、高壓滅菌、輻射、超聲處理等。分子生物學(xué)方法：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)阻礙多酚氧化酶的表達(dá)、使用反義RNA技術(shù)降低多酚氧化酶活性等。第23頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促褐變:較淺色的水果、蔬菜在受到機(jī)械性損傷（削皮、切片、壓傷、蟲咬、磨漿、搗碎）及處于異常環(huán)境變化（受凍、受熱等），在酶促催化下氧化而呈褐色，稱為酶促褐變。西瓜、香瓜、桔子、檸檬無酚酶，不褐變。第24頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)例1：土豆的褐變第25頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)例2：含有兒茶酚水果的褐變第26頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月褐變防止方法酶促褐變的三個(gè)條件，缺一不可。即：多酚類物質(zhì)、多酚氧化酶、氧氣除去多酚類物質(zhì)困難，不現(xiàn)實(shí)?！嘁话銥榻档投喾友趸富钚?、驅(qū)氧

第27頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)加熱鈍化酶活性75～95℃、5～7S的加熱處理，可使大部分酶活性喪失。常用的方法有：漂燙、巴氏殺菌

加工中，必須嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度。加熱溫度過高，加熱時(shí)間過長，可抑制酶褐變，但會影響食品品質(zhì)；加熱不足，不能抑制酶褐變。微波加熱，熱穿透力強(qiáng)，迅速均勻，不影響風(fēng)味。第28頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)螯合酶促作用的金屬離子多酚氧化酶是以銅作為輔基的金屬蛋白。金屬（鐵、錫、鋁等）離子是多酚氧化酶的激活劑。檸檬酸對Cu2+有螯合作用。EDTA是一種金屬離子螯合劑，可阻止金屬離子對褐變反應(yīng)的促進(jìn)作用，但其與作用對象有關(guān)，有的效果則不明顯。第29頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)酸處理法多數(shù)酚酶最適pH＝6～7，pH<3失活(高酸性環(huán)境會使酶蛋白上的銅離子解離下來，導(dǎo)致多酚氧化酶逐漸失活，酶活性趨于最低。)常用的酸有：檸檬酸、蘋果酸、磷酸、抗壞血酸、混合酸。第30頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月檸檬酸可降低pH，還可絡(luò)合酚酶輔基Cu2+，但單獨(dú)用效果不大。常與抗壞血酸、亞硫酸合用。實(shí)踐證明：0.5%檸檬酸+0.3%抗壞血酸效果好。抗壞血酸不但能降低體系pH，而且具有還原劑的作用，可將體系中的醌類及其衍生物還原成酚，并通過自身氧化來減少體系的含氧量。第31頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月抗壞血酸抑制酶褐變的機(jī)理（圖）第32頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）酶活抑制劑亞硫酸類是最常用的多酚氧化酶抑制劑。常用的有：二氧化硫、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、低亞硫酸鈉(Na2S2O4)如：在蘑菇、馬鈴薯、桃、蘋果等加工中，常用二氧化硫及亞硫酸鹽類作護(hù)色劑。防止褐變的原因有三：a.抑制多酚氧化酶活性b.將醌還原為酚c.與醌反應(yīng)生成無色加成產(chǎn)物第33頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月(5)驅(qū)氧通過沸水燙漂、抽真空（93kPa，5～15min）、高濃度抗壞血酸溶液浸泡、氣調(diào)包裝設(shè)計(jì)等均可達(dá)到驅(qū)除食品內(nèi)氧氣的目的，從而抑制酶褐變的發(fā)生?？刂蒲鯕夂坑贸榭仗幚砑夹g(shù)或添加去氧劑等方法：用2%食鹽+0.2%檸檬酸+0.06%偏重亞硫酸鈉溶液作抽空液，在500mmHg的真空度抽真空5～10min,可取得良好的護(hù)色效果。

第34頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月五、多酚氧化酶的分子形式多酚氧化酶有多種分子形式原因：①類似的亞基不同程度的聚合；②不同亞基不同方式的結(jié)合;③酶蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變;④前三種情況的結(jié)合。多酚氧化酶多種分子形式之間的差別表現(xiàn)在底物特異性、最適pH、溫度穩(wěn)定性、對抑制劑敏感性、氧化和羥基化活力的差別。第35頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月六、多酚氧化酶活力測定多酚氧化酶的提取方法：丙酮粉法勻漿法勻漿浸提法第36頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月多酚氧化酶的測定方法：（1）檢壓法：在一定溫度、pH和基質(zhì)濃度下，多酚氧化酶氧化基質(zhì)的速度與單位時(shí)間內(nèi)的耗氧量成正比。用瓦氏呼吸計(jì)測定耗氧率。（2）氧電極法：利用氧電極測定反應(yīng)中的耗氧量來表示酶活力第37頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）分光光度法：多酚氧化酶催化鄰苯二酚氧化成有色產(chǎn)物，單位時(shí)間內(nèi)有色產(chǎn)物在460nm處的吸光度與酶活強(qiáng)弱成正比。（4）碘量滴定法分光光度法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，最為常用。第38頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物正常條件下，在未受損水果中，酚類物質(zhì)是與多酚氧化酶存在于不同部位。這種分布是通過一系列膜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，受膜屏障的作用，這種區(qū)域性的分布阻止了底物和酶的相互接觸，所以正常組織是不發(fā)生褐變的，一旦膜系統(tǒng)受損，使物質(zhì)的區(qū)域化分布破壞，多酚氧化酶與酚類物質(zhì)接近并與其發(fā)生化學(xué)作用，這將導(dǎo)致褐變。第39頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月1.蘋果中多酚氧化酶多酚氧化酶是引起蘋果褐變的重要原因之一在蘋果生長過程中，總酚含量逐漸下降，至成熟期穩(wěn)定，酶活力變化趨勢與總酚類似。未成熟的蘋果比成熟的更易褐變在大多數(shù)情況下，酶促褐變傾向在保藏期間是增加的。機(jī)械損傷可引起酶促褐變，但褐變的速率起初較高，隨后下降到零。第40頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2.梨中的多酚氧化酶梨多酚氧化酶僅作用于鄰苯酚,對于對苯酚、間苯酚和一元酚無作用以兒茶酚為底物,該酶的最適pH為6.5,在30℃活性最強(qiáng).亞硫酸氫鈉、維生素C、檸檬酸對梨中多酚氧化酶的抑制作用依次減弱,硫酸鈉幾乎無抑制作用。不同底物和同底物不同濃度影響多酚氧化酶特性。第4