第五章基因組本章重點:基因定位序列作圖基因克隆1基因組：單倍體細(xì)胞中所含的整套染色體。

基因組：單倍體細(xì)胞中所含的整套染色體所包含的DNA分子以及DNA分子所攜帶的全部遺傳指令。人類基因組：22條常染色體和X、Y染色體的DNA組成。

基因組2

生物體單倍體DNA總量稱為C值。

C值最大最小相差10萬倍。

C值同生物進(jìn)化是什么關(guān)系？一、C值悖論和序列復(fù)雜性§1、

C值悖理（C-valueparadox）第一節(jié)基因組DNA序列組成3基因組大小

種類Mb大腸桿菌4.64啤酒酵母12.1線蟲100.0果蠅140.0蝗蟲5000.0小鼠3300.0豌豆4800.0玉米5000.0小麥17000.0

人3000.0

4霉菌藻類G+細(xì)菌G-細(xì)菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類賴皮類甲殼類昆蟲類軟體動物蠕蟲類真菌枝原體A生物體進(jìn)化程度高低與大C值不成明顯正相關(guān)B親緣關(guān)系相近的生物大C值相差較大C同一類生物內(nèi)大C值與小c值相差極大（Euk.人體c=C/10）

(Prok.Φx174c＞C)

5

在同一類生物中，不同種的基因組大小也有很大差別。C值悖理，從總體上說，生物基因組的大小同生物在進(jìn)化上所處的地位高低無關(guān)，這種現(xiàn)象稱為C值悖論。6§2、序列復(fù)雜性在同一類生物中，不同種的基因組大小懸殊差別。主要差別在于“多余”（excess）DNA的量的差別?！岸嘤唷盌NA量多，則基因組大；“多余”DNA量少，則基因組小?！岸嘤唷盌NA主要是重復(fù)序列。序列復(fù)雜性:不同序列的總長度稱為序列復(fù)雜性,用bp表示。

140bp:(1)20bp,30bp,40bp,50bp20+30+40+50=140bp(2)70bp(2個拷貝)70=70bp序列復(fù)雜性高低反映了序列包含的遺傳信息量的大小。生物體基因組的復(fù)雜程度還表現(xiàn)在基因的外顯子數(shù)目的多寡。7二、基因組DNA序列的分類1、編碼序列和非編碼序

編碼序列：編碼RNA和蛋白質(zhì)的DNA序列。非編碼序：內(nèi)含子和基因的間隔序列。2、單一序列和重復(fù)序列

單一序列：基因組中只有一份的DNA序列。重復(fù)序列：基因組中重復(fù)出現(xiàn)的序列。如STR,微衛(wèi)星DNA等8重復(fù)序列高度重復(fù)序列。幾百---幾百萬個拷貝。Alufamily輕度重復(fù)序列。2—10個拷貝。中度重復(fù)序列。10—幾百個拷貝。rDNA、tDNA原核生物基因組幾乎不含重復(fù)序列；低等真核生物基因組中，中度重復(fù)和高度重復(fù)序列不超過20%；動物細(xì)胞基因組中，中度重復(fù)和高度重復(fù)序列約占50%；顯花植物和兩棲動物基因組中，中度重復(fù)和高度重復(fù)序列幾乎可達(dá)80%重復(fù)序列9三、DNA復(fù)性動力學(xué)●

D.S.DNAS.S.DNA

(加溫,極端pH)

▼Renaturation

復(fù)性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞

(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

10影響復(fù)性的因素：真核生物：第1組分（25%），快，高度重復(fù)序列；第2組分（30%），中，中度重復(fù)序列；第3組分（45%），慢，單一或少拷貝；

溫度時間離子強度

DNA片段大小

DNA序列復(fù)雜性

DNA分子濃度11四、重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族:是指一類核苷酸序列高度相似的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列包括基因和基因以外的序列。基因家族:真核生物基因組中來源相同，結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的一組基因可歸為一個基因家族?；蚣易蹇蓺w入重復(fù)序列家族，但不是其主要組成，主要組成基因以外的序列。12散在重復(fù)序列散在重復(fù)序列：散在的方式分布于基因組內(nèi)的重復(fù)序列。

短散在重復(fù)序列（SINEs）,500bp長散在重復(fù)序列（LINEs）,1000bpAlu序列家族：人類50-70萬拷貝；人和靈長類基因標(biāo)志。多聚（dT-dG）家族：10萬拷貝13基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)基因和基因組的結(jié)構(gòu)各種元件的序列特征基因作圖和基因定位不同序列結(jié)構(gòu)具有不同功能基因表達(dá)的調(diào)控基因與環(huán)境相互作用轉(zhuǎn)錄物組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)表型組學(xué)第二節(jié)基因組研究14一、人類基因組研究1986[美]Dulbecco首次提出了“人類基因組工程”1990.4月美國宣布人類基因組測序工作的5年計劃。2001.1.12中、美、日、德、法、英等國科學(xué)家（Nature,15日)和美國塞萊拉公司(Science,16日)各自公布人類基因組圖譜和初步分析結(jié)果。約3萬基因。我國參與研究的第3號染色體，共計3000萬個堿基對，約占人類基因組全部序列1%（1999.9月加入這一研究計劃）。151、遺傳圖：遺傳圖以染色體上某一點為遺傳標(biāo)記，以與之相伴遺傳的特征為對象，通過計算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定它們的相對距離(單位：cM,厘摩)；2、物理圖：以特定的DNA序列為標(biāo)界，將各種標(biāo)記直接定位在基因庫中的某一點上。物理圖上標(biāo)界之間的距離以物理長度來表示，即以核苷酸對的數(shù)目來表示（單位：bp,kb）；3、序列圖：核苷酸組成的基因組全部DNA序列。4、基因圖：測定這些可表達(dá)片段（EST）的標(biāo)記圖。人類基因組框架圖16人類基因組計劃（HGP）遺傳圖物理圖序列圖基因圖基因定位

基因克隆

基因轉(zhuǎn)移

比較基因組研究物種的起源與進(jìn)化基因的證實與克隆生物學(xué)的發(fā)展水稻等作物基因組計劃豬，牛等家畜基因組計劃17二、基因定位和作圖§1、基因標(biāo)記和作圖界標(biāo)基因標(biāo)記：利用可鑒別的形態(tài)、生化等表型性狀作標(biāo)記。如：血型、蛋白質(zhì)氨基酸、等位基因等圖譜標(biāo)記：可用基因或DNA作為可鑒別的標(biāo)記(marker)?；驑?biāo)記和DNA的分子標(biāo)記。分子標(biāo)記：特定DNA序列構(gòu)建遺傳圖譜的標(biāo)記。

每種生物DNA具有穩(wěn)定性。18

（1）RFLPrestrictfragmentlengthpolymorphism限制性片段長度多態(tài)性（2）SSLPsimplesequencelengthpolymorphism簡單序列長度多態(tài)性

（3）SNPsinglenucleotidepolymorphism

單核苷酸多態(tài)性

（4）STS/EST非多態(tài)的短單一序列作為標(biāo)界DNA的分子標(biāo)記RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA隨機擴增多態(tài)性AFLP

amplifiedfragmentlengthpolymorphism

擴增片段長度多態(tài)性19如一對同源染色體二個DNA分子，一個具有某種酶的酶切位點，另一個無此位點酶切后形成的DNA片段長度就會有差異，即多態(tài)性(RFLP)根據(jù)該等位基因的遺傳，將RFLP作為標(biāo)記定位在基因組的某一位置上。限制性內(nèi)切酶多態(tài)性:限制性內(nèi)切酶能識別和切割特異核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，實際上相當(dāng)于一對等位基因的差異。（1）

RFLP限制性片段長度多態(tài)性20（2）

簡單序列長度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymor-phisms,SSLP)簡單序列長度多態(tài)性,又稱為VNTR

variablenumbertandemrepeat

數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性。指重復(fù)單位相對較小,由重復(fù)單位的序列差異和數(shù)目變化,可形成豐富的多態(tài)性。

包括:小衛(wèi)星序列、微衛(wèi)星序列。小衛(wèi)星序列(microsatellite):又稱簡單重復(fù)序列(STRs)，常只有2~4個核苷酸重復(fù)單位。微衛(wèi)星(minisatellite)也稱多次重復(fù)序列(VNTR)，重復(fù)序列長度為幾十個核苷酸。由于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強的單一序列，據(jù)串聯(lián)重復(fù)排列微衛(wèi)星基序兩側(cè)的單一序列可以人工合成引物,對微衛(wèi)星序列（microsatelliteDNA或simplesequencerepeats，SSR）進(jìn)行擴增，從而將單個微衛(wèi)星位點擴增出來,由微衛(wèi)星基序重復(fù)數(shù)目的變異而產(chǎn)生多態(tài)性。21隨機擴增片段長度多態(tài)性DNA，簡稱RAPD技術(shù)，是由Williams和Welsh（1990）同時發(fā)展起來的一項新的遺傳標(biāo)記技術(shù)。RAPD以PCR為基礎(chǔ)而又不同于經(jīng)典的PCR，一般采用10個核苷酸的DNA序列為引物，擴增時退火溫度降至35℃左右。與其他標(biāo)記相比,RAPD具有以下優(yōu)點：①不依賴于種屬的特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成的一套引物可用于不同生物的分析。②操作簡單，可實現(xiàn)自動化，短期內(nèi)可利用大量引物完成覆蓋的分析。③不需制備探針、雜交等程序，成本較低。④DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析）,允許快速、簡單地分離DNA。已在遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源分析、基因標(biāo)記等方面得到了廣泛的應(yīng)用。RAPD是一種顯性標(biāo)記,分離群體中純合體和雜合體通過后代才能區(qū)別，并且由于該技術(shù)采用的是隨機引物擴增，擴增結(jié)果的穩(wěn)定性較差，這在一定程度上限制了其發(fā)展。（3）隨機擴增片段長度多態(tài)性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD

）22AFLP是指通過PCR擴增經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的基因組DNA模板產(chǎn)生顯示多態(tài)性的DNA片段。這一方法最初是在1992年由荷蘭一家私人公司提出的。其原理和步驟大致為：將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切成片段，在DNA片段兩端連接上一段已知序列，再以該已知序列為基礎(chǔ)，加上2~3個隨機變化的核苷酸序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴增和進(jìn)一步檢測。AFLP技術(shù)是在RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合RFLP技術(shù)產(chǎn)生的。由于AFLP引物的特異性比RAPD的隨機引物強，從而克服了RAPD重復(fù)性差的問題，還可以通過增減引物的長度來控制PCR擴增帶型的復(fù)雜程度。這一方法的缺點是技術(shù)操作較為復(fù)雜、成本也較高。對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，形成分子量大小不同的隨機限制片段，再進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)擴增片段長度的多態(tài)性的比較分析，可用于構(gòu)建遺傳圖譜、標(biāo)定基因和雜種鑒定以輔助育種。

（4）擴增片段長度多態(tài)性分析

23DNA指紋圖譜24主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達(dá)300萬個甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。

單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）氯吡格雷(抗凝藥)

25§2、基因定位(1)植物基因定位：借助基因標(biāo)記和DNA的分子標(biāo)記，可使基因定位在精度、深度、廣度等方面有極大的提高。已陸續(xù)在一些農(nóng)作物上定位了許多重要農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟性狀的基因，在復(fù)雜數(shù)量性狀位點(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大進(jìn)展。26

中斷雜交實驗(min)：

F+

×F–

Hfr×F–（2）細(xì)菌的基因定位27（3）人類家系分析定位

Y染色體X染色體常染色體：

28（4）原位雜交定位DNA或RNA分子探針

放射性標(biāo)記分子雜交顯影/顯色基因定位29（1）酶切完全酶切部分酶切§3、序列圖作圖（1）酶切（2）疊連群建立（3）序列測定30（2）疊連群建立31（3）序列測定①DNA測定的酶法，②化學(xué)測序法③DNA自動測序32DNA測定的酶法：即Sanger法、終止法、雙脫氧法

DNA聚合酶，單鏈DNA模板，引物復(fù)性后分4份加4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和

dCTP），其中一種為α-32P標(biāo)記各加一種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）,3’

缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜直接讀得DNA的堿基序列序列測定方法之一AGTTGCTA33化學(xué)測序法又稱Maxam-Gilbert法序列測定方法之二把待測序的DNA分子成單鏈分子，其5’端用32P進(jìn)行放射性標(biāo)記。分成4份，每份用一種化學(xué)試劑處理DNA片段，每種試劑可使DNA分子在一種堿基的5’端的磷酸二酯鍵處發(fā)生斷裂。使每個DNA分子只發(fā)生一次斷裂。把這4種反應(yīng)產(chǎn)物用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離，用X光膠片進(jìn)行曝光，得到一張由不同條帶組成的序列圖。從圖上就可以讀出待測DNA片段的堿基序列。34序列測定方法之三DNA自動測序儀：根據(jù)Sanger法酶促原理

4種熒光染料標(biāo)記引物激光照射閱讀4種顏色35GACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAA1.部分酶切3.疊連群建立2.DNA測序CTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCA36克隆:是英文Clone一詞的單譯，意為無性繁殖系，即通過無性繁殖（如細(xì)胞絲分裂）可連續(xù)傳代并形成的群體，常用于細(xì)胞水平的描述。克隆技術(shù)（Cloning）:則指由眾多的基因或細(xì)胞群體中通過無性繁殖和選擇獲得目的基因或細(xì)胞的技術(shù)操作。基因克隆:是指某種目的基因的分離過程，通常是將生物材料的遺傳物質(zhì)如DNA以酶切成片斷，插入到載體中，通過無性繁殖（細(xì)菌或細(xì)胞的倍增）使其擴增，然后再以某種探針選擇、釣取目的基因?！?、基因克?。–lone）基因克隆策略：1）功能克隆：

2）定位克?。?/p>

371）功能克隆克隆（致?。┗虻囊环N策略。收集所要克隆的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功能的信息，用以分離基因，并對基因進(jìn)行定位。性狀（疾病）蛋白質(zhì)產(chǎn)物（生物學(xué)功能）從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計DNA引物，從文庫調(diào)取基因得到基因序列染色體定位疾病功能基因38血紅蛋白病——鐮刀形細(xì)胞貧血癥正常HbA四條多肽鏈（2條鏈，兩條鏈）39

2）定位克隆又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于20世紀(jì)80年代后期利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置克隆：從定位的染色體區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。疾病遺傳標(biāo)記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能

疾病

基因功能40賀林實驗室利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進(jìn)行了精確定位（位點定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個突變位點是導(dǎo)致A-1型短指（趾）癥的直接原因。A-1型短指（趾）——癥位點定在2q35-36區(qū)411）構(gòu)建基因文庫：用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個個片段，然后將這些片段隨機地連接在某些質(zhì)?；蚱渌d體上，再將它們轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞的增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系（克?。?，當(dāng)這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。cDNA文庫基因克隆具體方法：422）篩選文庫：用放射性同位素或非放射性化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記探針（待克隆的基因或cDNA的一段同源序列）同文庫的細(xì)菌克隆或噬菌斑作核酸分子雜交經(jīng)放射自顯影或顯色反應(yīng)后，可以篩選出含有同探針互補序列的細(xì)菌克隆或噬菌斑然后分析這些重組載體中所插入的DNA片段或cDNA最后分離出所要的基因或cDNA。

433）染色體步移知道距該基因一定距離上的一段DNA序列用該DNA序列作探針,篩查文庫,得到陽性克隆分離出來重組載體中的插入片段用這個片段的末端部分作探針再一輪篩查文庫得到新的重組載體中的插入片段再用新得的插入片段的末端部分作為探針，再去篩查文庫通過一系列的操作，得到的插入片段逐漸連接延伸，最后可以步移到待克隆的基因444）電子雜交ESTexpressedsequencetag,EST表達(dá)序列標(biāo)簽，短的、單次（測序）閱讀的cDNA序列。

EST1200-300bp的cDNA片段用EST1搜索EST數(shù)據(jù)庫得到含一段共同序列另一個新EST2EST1、EST2拼接延伸成為EST3

用EST3搜索EST數(shù)據(jù)庫得到EST4EST3、EST4拼接延伸EST5

用EST5搜索EST數(shù)據(jù)庫┇

全長cDNA序列。全cDNA序列探針，cDNA文庫篩查，PCR擴增全cDNA基因45四、