第八章PCR技術及其應用前言PCR技術簡史第一節(jié)PCR技術原理和工作方式第二節(jié)PCR產物的克隆第三節(jié)PCR擴增未知DNA片段第四節(jié)與反轉錄相關的PCR第五節(jié)PCR產生DNA指紋第六節(jié)實時定量PCR本課件是在網絡資源基礎上改進而成，在此對有關人士特致感謝！第八章PCR技術及其應用前言PCR技術簡史本課件是在一、PCR的基本原理類似于DNA的體內復制。首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復。第一節(jié)PCR技術原理和工作方式一、PCR的基本原理類似于DNA的體內復制。第一節(jié)PCRDenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至95℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；PCRCycle-Step1–DenaturetemplateDNAbyheatPCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；PCRCycle-Step2–

TemperaPCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。PCRCycle-Step3-

At72Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。Endofthe1stPCRCycle–

R2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程71

緩沖液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室溫時約為7.2)，還可能有添加劑、共溶劑等。廠商一般以10倍的貯存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。廠商一般以25mmolMgCl2+形式提供，使用濃度為0.5mmol/L至2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTPs、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。二、PCR反應體系2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程71緩沖液2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程82、脫氧三磷酸核苷(dNTPs)

dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。廠商一般提供為10mmol/L或4mmol/L的貯存液，使用濃度為0.2mmol/L左右。

dNTPs濃度取決于擴增片段的長度。濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量。

dNTPs可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程82、脫氧三2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程9PCR引物的設計一般原則1.引物長度一般以18～30bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的成本。2.解鏈溫度(Tm值)很重要，直接決定了擴增中可使用的退火溫度(Ta值)的高低，較高時特異性增加，但退火效率下降，過低時退火效率較高，但特異性下降。兩條引物間的Tm值越接近越好。計算Tm值的方法很多，簡易公式為Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，適于短于20nt的引物。長引物的Tm值計算公式見書，但比實際值往往偏低。精確的Tm計算需要考慮緩沖液的鹽離子濃度和引物內部的相鄰堿基的動力學參數。3、引物

一般溶成10mol/L的貯存液，使用濃度為0.1-0.5mol/L。

濃度過低則產量低，過高則易導致錯配，PCR特異性下降。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程9PCR引物2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程103.避免引物內部出現二級結構，避免序列內有較長的回文結構，使引物自身不能形成發(fā)夾結構。4.要避免兩個引物間特別是3’末端堿基序列互補以及同一引物自身3’末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)夾結構。5.G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布，避免出現嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。6.引物3’末端堿基一般應與模板DNA嚴格配對，并且3’末端為G、C或T時引發(fā)效率較高，但3’要避免較密的C+C或G+C連排。7.引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關的序列(如限制性核酸內切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求。8.引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程103.避免2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程114、模板單、雙鏈DNA均可。一個PCR反應中104至107個模板分子可獲得較理想的效果，但由于PCR較靈敏，更少的模板分子數在循環(huán)數增加時也會得到大量擴增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類，模板純度不高往往是限制PCR擴增的重要因素。

不同屬性的模板所加的理想的量不同，哺乳動物基因組總DNA、酵母DNA、細菌DNA、質粒、M13噬菌體作模板時，需要的量分別為1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。

模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程114、模板2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程125、耐熱性的DNA聚合酶有多種，均從耐熱性的細菌中分離出來，均耐高溫，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性(proofreading,校正功能，決定保真度,fidelity)、耐熱性和附加功能上有差異。酶量增加使產量增加，但反應特異性下降，酶量過少雖能保證特異性，但影響產量。常用的有：

1）TaqDNA聚合酶：最常用，來自嗜熱水生菌(Thermusaquaticus)，95℃時的半衰期為40分鐘，75℃時活性最強，沒有校正功能，錯配率為8.9×10-5至1.1×10-4。標準使用濃度一般為2.5U/50l。2）TthDNA聚合酶：來自嗜熱熱細菌(Thermusthermophilus)HB8，95℃時的半衰期為20分鐘，74℃時進行擴增，除在Mg2+催化下進行常規(guī)的PCR擴增外，還具有在MnCl2催化下的高溫反轉錄功能。

3）VentDNA聚合酶：來自嗜熱高溫球菌(Thermococcuslitoralis)，100℃時的半衰期為1.8小時，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程125、耐熱2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程134）PwoDNA聚合酶：來自嗜熱細菌(Pyrococcuswoesei)，100℃時的半衰期大于2小時，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：來自激烈熱球菌(Pyrococcusfariosus)，具有極高的熱穩(wěn)定性，目前公認是最保真的。

6）混合DNA聚合酶：將具有校正功能的酶與Taq酶按一定比例混合，具有類似Taq的強啟動合成能力，同時又有一定的保真度，而且具有一定的擴增長片段的能力。Taq酶的延伸速度為1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min來預計。

PCR擴增不是絕對真實的，因為具校正功能的DNA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相對保真而已，錯配率相差在兩個數量級以內。一些具校正功能的酶作PCR時，即使產物短也可能得不到產物，原因不明，估計可能與該酶的外切活性將引物降解有關。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程132023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程14三、PCR反應程序1、常規(guī)程序：94℃左右預變性幾十秒至幾分鐘；

94℃左右變性10秒至1分鐘；50-65℃左右退火30秒至1分鐘；20-35個循環(huán)72℃左右延伸30秒至幾分鐘；72℃左右最后延伸和加尾3-10分鐘；4-25℃保持3分鐘或更長。2、退火和延伸溫度：

退火溫度Ta值由Tm值決定，多數情況下Ta采用Tm減去3-5℃，較高時特異性強但退火效率低，較低時退火效率增加而非特異擴增增加，可根據實際研究目的采用高特異性或低特異性退火。當退火溫度高到與延伸溫度接近時，可以將退火和延伸溫度合為一個，這時PCR就由三步法變成了兩步法。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程14三、PC2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程153、反應時間：變性步驟一般為5秒至1分鐘，變性溫度高時時間短，低時時間長，簡單模板時間短，復雜模板時間長，尤其是直接用細胞作模板時預變性和變性時間都要長。

退火時間一般為30秒至1分鐘即可，引物結構好的時間短，引物結構差的退火時間宜長。

延伸時間從半分鐘到10分鐘以上不等，由擴增片段的長度和DNA聚合酶的延伸速度共同決定。Taq擴增時按1kb/min計算，具校正活性的酶則按0.6-0.7kb/min計算。4、循環(huán)次數：多數為25-35，主要取決于模板屬性、模板豐度、引物退火效率DNA聚合酶的擴增能力。裸露DNA、雜質少、高豐度模板、引物結構好、DNA聚合酶擴增能力強時，循環(huán)數宜少，以盡量減少突變。否則宜多，以保證獲得必要的PCR產物量。

PCR擴增的后期循環(huán)易進入平臺期，實際上是由于PCR擴增條件的逐步劣化而引起的。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程153、反應2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程165、PCR反應液的配制：

加試劑順序：雙蒸水、緩沖液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前應將其余試劑混勻后再加入酶。加完酶后應先放回酶，然后再混勻PCR成分，覆蓋礦物油，并上機。酶要用冰盒取放，禁止因手的接觸或暴露于空氣中而使酶升溫。第一次使用各試劑時要輕柔充分混勻。正確保存各種試劑，尤其是要避免核酸因反復凍融而降解，各試劑宜分裝成適量的小管。

熱啟動(hotstart)：購買的DNA聚合酶偶連有特異抗體，只有當溫度升至68度或更高時，抗體才會失活并釋放出DNA聚合酶，從而增加PCR的特異性，減少低溫下尤其是配制PCR體系過程中由于引物錯配而帶來的非特異性擴進。但啟動的DNA聚合酶的價格較貴。早期有蠟珠法。冷啟動(coolstart)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已運行并暫停于預變性之初的PCR儀的block上面，直接進入高溫變性和隨后的PCR擴增。延遲成分法：扣留一種PCR關鍵成分，直到已進入預變性后才加入。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程165、PCPCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的特點PCR中其它注意的事項1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作2.設立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板、無模板試劑對照：除模板外的所有組分PCR中其它注意的事項1.防止污染第二節(jié)PCR產物的克隆一、在PCR產物兩端添加限制性酶切位點在PCR引物的5’加上根據需要而設計的酶切位點，PCR產物內部沒有該切點。在酶切位點的5’加3個左右的保護堿基，基數目多少取決該酶的性質。PCR物產物經電泳后回收后，直接用限制酶進行切割，純化后與目標載體連接重組。該法適用于直接將PCR產物克隆到表達載體進行功能研究，但構建好的表達載體必須測序才能證明PCR產物的身份正確且沒有突變。第二節(jié)PCR產物的克隆一、在PCR產物兩端添加限制性酶切2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程20二、TA克隆這是目前最通行的PCR產物克隆方法，基本思路是先將PCR產物與特制的T載體進行連接重組，測序證明正確無誤后，再從T載體上亞克隆到表達載體上進行功能研究。Taq酶PCR產物的特點：該酶具有末端轉移酶活性，通常在其產物DNA分子每條鏈的3’末端加上一個突出的A。T載體：通過特定制作技術制作的在多克隆位點中間已開環(huán)的質粒載體，其每條鏈的3’末端具有一個突出的T，如promega公司的pGEMT-easy。TA克隆：將3’末端具一個突出的A的PCR產物與T載體連接重組，轉化大腸桿菌，對鑒定為陽性的重組克隆子的多克隆位點區(qū)的插入片段進行測序，然后再亞克隆到其它載體進行功能研究等。pCR-TOPO技術：T載體上已經偶連有拓撲異構酶，因此PCR產物無需DNA連接酶而可直接與該T載體進行快速連接重組。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程20二、TA2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程21三、平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶擴增出來的PCR產物均為平末端，有兩種克隆思路：一是在PCR完成后加入適量的Taq酶并在72℃保溫20-30分鐘，使PCR產物每條鏈的3’末端加上一個突出的A后進行TA克隆。二是將平末端PCR產物與平末端進行載體連接克隆：1、pCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體：連接體系中除加有T4DNA連接酶外，還加有限制酶SrfⅠ，連接過程中載體自連的產物總是被SrfⅠ切開，而重組載體確不能被切開，轉化子中重組子的比例就較高。2、pCR-Blunt克隆載體：載體的lacZ’基因下游融合了一個致死基因ccdB，載體自連轉化的大腸桿菌不能存活，重組載體的轉化子則能長成菌落，因為致死基因已被插入失活。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程21三、平末2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程22四、長片段DNA的PCR擴增長片段DNA的PCR擴增效率較低，因為有許多降低PCR效率的因素。策略有：一是改進PCR緩沖液體系。二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴增40kb左右的片段。2023/8/1西南大學生物技術專業(yè)基因工程22四、長片一、反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增?？蓪ξ粗蛄袛U增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列第三節(jié)PCR擴增未知DNA片段一、反向PCR(reversePCR)是用反向的互二、利用接頭的PCR/錨定PCR(anchoredPCR)

將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列已知的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與已知序列中的基因特異引物(gene-specificprimer,GSP)組合后，用于目標基因側翼序列的擴增。為了減少錨定引物與錨定引物之間組合后構成的非特異擴增，可以將接頭替換為一端平、另一端為5’突變的結構，且對3’凹陷的堿基實行亞氨基修飾。二、利用接頭的PCR/錨定PCR(anchoredPCR不對稱PCR

目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結構功能的研究三、熱不對稱交錯PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)

不對稱PCR三、熱不對稱交錯PCR(thermalasy2023/8/9西南大學生物技術專業(yè)基因工程26TAIL-PCR：利用特異引物與隨機引物組合后進行PCR，產生3種產物：Ⅰ型產物：特異引物和隨機引物共同延伸的產物；Ⅱ型產物：特異引物單獨延伸的產物；Ⅲ型產物：隨機引物單獨延伸的產物。5輪高嚴謹度PCR，形成特異引物介導的目標序列的單鏈擴增；1個低嚴謹度PCR循環(huán)，將目標序列轉換為雙鏈；高嚴謹度與低嚴謹度循環(huán)交錯進行，共14個超級循環(huán)；PCR產物稀釋1000倍；換用新的特異