銅綠假單胞菌金屬-內(nèi)酰胺酶的研究

銅綠假單胞菌是醫(yī)院常見(jiàn)的感染條件，臨床感染率為14%。目前臨床上使用的抗銅綠假單胞菌較為有效的藥物為碳青酶烯類(lèi)抗生素。然而近年來(lái)由于亞胺培南等碳青酶烯類(lèi)抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌產(chǎn)生了一類(lèi)能廣泛水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的金屬β-內(nèi)酰胺酶,產(chǎn)該類(lèi)酶的細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)所有抗生素產(chǎn)生耐藥性,給臨床抗感染治療造成極大困難,而且目前產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌種類(lèi)和數(shù)量在不斷增加,已報(bào)道的主要有IMP和VIM兩種類(lèi)型1材料和方法1.1菌株的收集耐亞胺培南和(或)頭孢他啶的銅綠假單胞菌144株,收集2005年5月~2007年5月廣東省中醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、南方醫(yī)院、中山大學(xué)第二附屬醫(yī)院的住院患者的痰液、尿液、傷口分泌物等各種送檢培養(yǎng)標(biāo)本,菌株收集無(wú)重復(fù),以干紙片-70℃低溫保存,臨用前復(fù)蘇。將所有菌株復(fù)蘇后用VITEK-32全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)重新進(jìn)行鑒定,不符合者以本次鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。1.2比較消毒菌IMP-A陽(yáng)性銅綠假單胞菌由中山大學(xué)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化研究中心饋贈(zèng)。1.3質(zhì)量控制菌株藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌菌株ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。1.4藥粉和藥劑M-H營(yíng)養(yǎng)瓊脂干粉:法國(guó)Biomerieux公司;亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安曲南(ATM)、環(huán)丙沙星(CIP)和左旋氧氟沙星(LEV)藥粉均購(gòu)自廣東省藥品局。1.5高速冷凍離心系統(tǒng)VITEK-32全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng):法國(guó)Biomerieux公司。2K15型高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Sigma公司。GeneAmpPCRSystem2700型擴(kuò)增儀:美國(guó)PE公司。全自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng):法國(guó)VL公司。1.6mic值的測(cè)量參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)2007年的標(biāo)準(zhǔn),用瓊脂糖平皿二倍稀釋法測(cè)定銅綠假單胞菌對(duì)常用抗生素的MIC值。1.7銅綠假單胞菌原基因的基因型鑒定從網(wǎng)址的GeneBank中找到銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酞胺酶IMP及其全部亞型、VIM及其全部亞型、SPM-1和GIM-1基因型的原序列,利用Primer5.5軟件同時(shí)查閱參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物1.8統(tǒng)計(jì)處理計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2結(jié)果2.1imp型及imp-b型的篩選144株受試菌共擴(kuò)增IMP型陽(yáng)性25株,VIM型陽(yáng)性1株。其中IMP-A型1株陽(yáng)性,IMP-B型24株陽(yáng)性;VIM-A型1株陽(yáng)性,VIM-B型1株陽(yáng)性,但VIM-A與VIM-B型陽(yáng)性為同一菌株(圖1)。2.2測(cè)序結(jié)果及序列分析隨機(jī)各選取1例IMP-A和VIM-B引物擴(kuò)增陽(yáng)性的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果直接在NCBIGenBank中進(jìn)行序列對(duì)比分析,分別與IMP-A(GenBank注冊(cè)號(hào):AY033653)和VIM-B型金屬酶基因序列(GenBank注冊(cè)號(hào):AF191564)完全相同,說(shuō)明所產(chǎn)金屬酶基因型均與預(yù)期相符。2.3產(chǎn)mbl株與非產(chǎn)mbl株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較144株耐亞胺培南和/或頭孢他啶的銅綠假單胞菌,其中產(chǎn)MBL菌株26株,非產(chǎn)MBL菌株118株。MIC結(jié)果以幾何百分位數(shù)計(jì)算,產(chǎn)MBL株對(duì)美洛培南、頭孢吡肟和左氧氟沙星的不敏感率分別為42.31%、61.54%和38.46%,高于非產(chǎn)MBL株的17.79%、22.88%和18.64%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。產(chǎn)MBL菌株對(duì)其他抗生素的耐藥率均高于非產(chǎn)MBL株,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。3高耐亞胺培南的耐藥基因Sader等藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,產(chǎn)金屬酶的受試菌對(duì)臨床常用的多種抗菌藥物耐藥,耐藥率由高到低依次為氨基糖苷類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi),其中CIP耐藥率最低(17.57%)。產(chǎn)酶菌株高耐亞胺培南,其MIC值明顯高于不產(chǎn)酶菌株,而對(duì)環(huán)丙沙星較敏感,可能與目前本地區(qū)臨床少用環(huán)丙沙星有關(guān),與陳瑞等金屬β-內(nèi)酰胺酶由于其廣泛的水解底物(抗生素),獲得性金屬β-內(nèi)酰胺酶基因大多位于整合子和其他可移動(dòng)的基因元件,而且常和其他耐藥性基因一起存在,導(dǎo)致產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌多重耐藥,給臨床治療感染性疾病帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本次研究根據(jù)測(cè)序結(jié)果,僅能得出廣州地區(qū)IMP型